網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析
Summary
The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Abstract
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Introduction
グルタミン酸は網膜1における主要な興奮性神経伝達物質です。双極細胞2からのグルタミン酸作動性シナプス入力を受けた網膜神経節細胞（RGCを）は、脳に視覚情報を送信する網膜の出力ニューロンです。生理学的研究は、RGCのシナプスの励起がNMDA受容体（NMDARを）およびAMPA受容体（AMPA受容体）3,4,5によってシナプス後部媒介されることを示しました。網膜神経節細胞における興奮性シナプス後電流（EPSCs）はAMPA受容体とNMDARを3,5,6,7,8によって媒介されるが、RGCを上の自発的なミニチュアEPSCs（mEPSCs）が唯一のAMPA受容体媒介成分4,5,9を示します 。しかし、グルタミン酸の取り込みを低減することがRGCの樹状突起上のNMDARをが興奮性シナプスの外側に位置することができることを示唆し、自発EPSCs 5 NMDAR成分を明らかにしました。膜関連グアニル酸キナーゼなどPSD-95など（MAGUKs）はグルタミン酸受容体およびイオンチャネルを含むクラスタの神経伝達物質受容体、シナプス部位でのsが、また明確なシナプス下発現パターン10,11,12,13,14を示します 。
最近の数十年にわたって、共焦点免疫組織化学およびプレ埋め込み電子顕微鏡（EM）免疫組織化学は、膜受容体の発現を研究するために使用されてきました。共焦点免疫染色は、受容体の発現の幅広いパターンを明らかにしているが、その低解像度は、それが不可能な細胞内位置を区別するために使用することができます。哺乳動物の網膜の前埋め込 むEM研究は、NMDARサブユニットはコーン双極細胞のリボンシナプス15,16,17でのシナプス後要素に存在していることを示しています。これは、生理学的証拠には明らかとは対照的です。しかしながら、反応生成物の拡散は、プレ埋め込み免疫法における周知のアーチファクトです。したがって、このアプローチは、通常、統計的に信頼性の高いデータが得られていないとシナプス外膜18,19,20,21対シナプス膜への局在化との間の区別を除外することができます。に一方、生理学的および解剖学的データは、RGCを3,5,7,9,22上のAMPA受容体のシナプス局在と一致しています。したがって、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体とMAGUKsは、シナプス後にもperisynapticまたはシナプス外膜区画にだけでなく、ローカライズされています。しかし、網膜リボンシナプスにおけるこれらの膜タンパク質の高分解能定量分析が依然として必要とされています。
ここでは、NMDARサブユニットのシナプス下局在を調べるために、包埋後のEMの免疫技術を開発し、ラットのRGCにシナプスでのこれらのタンパク質の数、密度および変動性を推定することによって、続いAMPARサブユニットとPSD-95は、コレラ毒素サブユニットB（CTB）を用いて標識逆行性トレーシング方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
1）短いと弱い固定、2）、3）ポスト埋め込み免疫染色、および4）定量化置換をフリーズ：私たちは、埋め込み後イムノゴールドEM成功定量するための4つの技術を記載しています。
EMの免疫は、超薄組織切片中の特定のタンパク質の検出を可能にします。金粒子で標識された抗体は、直接EMを使用して可視化することができます。膜受容体のシナプス下局在を検出する際?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害に関する神経疾患・脳卒中研究所（NINDS）と国立研究所（NIDCD）、（NIH）の学内プログラムによってサポートされていました。私たちは、NINDS EM施設と支援のためのNIDCD高度なイメージングコア（コード＃ZIC DC 000081から03）をお願いいたします。
Materials
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
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