High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses
Summary
The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Abstract
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Introduction
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório na retina 1. Células ganglionares da retina (RGCs), recebendo entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, são os neurônios de saída da retina que enviam a informação visual ao cérebro. Estudos fisiológicos mostraram que a excitação sináptica das CGR é mediada por receptores de NMDA pós-sinapticamente (NMDAR) e os receptores de AMPA (AMPARs 3,4,5). Embora correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) em RGCs são mediadas por AMPARs e NMDAR 3,5,6,7,8, EPSCS miniatura espontâneas (mEPSCs) em RGCs exibem apenas um componente AMPARs mediada 4,5,9. No entanto, reduzindo a captação de glutamato revelou um componente NMDAR em EPSCS espontâneas 5, sugerindo que NMDAR em dendritos RGC pode ser localizado fora das sinapses excitatórias. guanilato quinases associadas a membranas (MAGUKs) como PSD-95 que os receptores de neurotransmissores, incluindo o agrupamento de receptores de glutamato e de canal iónicos em locais sinápticos, também apresentam padrões de expressão subsináptica distintas 10,11,12,13,14.
Nas últimas décadas, imuno-histoquímica confocal e pré-incorporação microscópio eletrônico de imuno-histoquímica (EM) foram utilizados para estudar a expressão do receptor de membrana. Embora imunocoloração confocal revela padrões gerais de expressão do receptor, a sua resolução mais baixa faz com que seja impossível utilizar para distinguir localização subcelular. Pré-incorporação de estudos de EM em retina de mamíferos indicam que subunidades NMDAr estão presentes em elementos pós-sinápticos no cone bipolares sinapses fita celular 15,16,17. Isto é, em aparente contraste com evidência fisiológica. No entanto, a difusão do produto da reacção é um artefacto bem conhecidos no método de imunoperoxidase pré-incorporação. Assim, esta abordagem não costumam dar os dados estatisticamente fiáveis e podem excluir distinção entre a localização de membrana sináptica contra 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EmPor outro lado, os dados fisiológicos e anatómicos são consistentes com uma localização sináptica de AMPARs em RGCs 3,5,7,9,22. Assim, os receptores de glutamato e na sinapse MAGUKs fita da retina estão localizadas não apenas para o pós-sináptica, mas também para os compartimentos membranares perisynaptic ou extrasynaptic. No entanto, uma análise quantitativa de alta resolução destas proteínas da membrana em uma sinapse fita da retina é ainda necessária.
Aqui, nós desenvolvemos uma técnica postembedding EM imuno para examinar a localização subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades Ampar e PSD-95, seguido de estimar o número, a densidade e a variabilidade destas proteínas nas sinapses Onto RGCs rato etiquetado usando subunidade da toxina da cólera B (CTB) métodos de rastreio retrógrada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos quatro técnicas para quantitativa pós-incorporação immunogold EM sucesso: 1) curta e fraca fixação, 2) freeze-substituição, 3) pós-incorporação coloração imuno, e 4) quantificação.
EM imuno permite a detecção de proteínas específicas em secções de tecido ultrafinas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pode ser directamente visualizada utilizando EM. Enquanto poderosa na detecção da localização subsináptica de um receptor de membrana, EM i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos programas internos do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) e do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação (NIDCD), um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Agradecemos a instalação de NINDS EM e do núcleo NIDCD Advanced Imaging (código # ZIC DC 000081-03) para obter assistência.
Materials
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
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