Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가
Summary
Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
Abstract
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Introduction
차 섬모는 대부분의 포유 동물 세포의 표면에서 연장 긴 미세 소관 기반의 부속 기관입니다. 차 섬모는 종종있는 항상 셀 당 여러가, 운동성 섬모와 혼동하고, 그 목적은 막 표면에서 유체를 이동하는 것입니다 수 있습니다. 차 섬모 대조적으로, 감각 역할을 채택하고 그 결과 또한 감각 섬모라고합니다. 일단 오래 잊고,이 세포 기관은 최근 인간의 유전 질환 1의 다수와의 연결의 결과로 '재발견'되고있다. 이상적 신호 소기관으로 위치 된 일차 섬모 수많은 시그널링 조직 항상성 및 질병뿐만 아니라 중요 이는 많은 경로,뿐만 아니라 개발이 과정을 조절하는 것으로 나타났다.
섬모 기능 장애와 연관되는 것으로 도시 제 1 시그널링 경로 중 하나가 평면 셀 극성 (PCP) 경로라고도 비정규 Wnt 신호 전달 경로이었다 <sup > 3. 처음 초파리에서 확인이 신호 캐스케이드, 배아 중요하다; 통합 및 확장 프로세스 특히와 상피 (4)의 평면에서 세포의 올바른 방향에 대해. 조절 단백질의 집합 코어의 연속 신호는 궁극적으로 세포 골격 재 배열로 이어질 및 평면 5 상피 세포의 조정 편광 될 방향 신호를 변환합니다. 융합과 확장의 과정은 절대적으로 연장하는 인공 와우 덕트과 올바른 휴대 패턴 (6)이 필요합니다. 이것은 PCP 경로의 활성화를 통해 조절된다으로 달팽이관 PCP 돌연변이의 가장 눈에 띄는 표현형 하나 무질서 감각 상피 7 단축 인공 덕트이다. 규제이 밝혀지지 남아 정확히 어떻게하지만 마찬가지로, 또한, 속눈썹이 부족 마우스 돌연변이는 이러한 통합 및 확장 표현형 8,9을 나타낸다.
통합 및 확장 프로세스가 인공 와우 덕트의 부산물 및 인공 와우 덕트 내의 감각 상피의 세포 패터닝 중요하기 때문에 ve_content는 ">, 개발 달팽이관은 척추 개발하는 동안 PCP 신호를 검사 할 수있는 이상적인 기관이다.의 기관 코르티, 인공 와우 덕트, 균일 (10)를 작동하는 달팽이관을 위해 지향해야 비 감각지지 세포와 mechanosensory 유모 세포로 구성되어 줄 전문 감각 상피에 주어진 용어입니다. mechanosensory 유모 세포 그렇게 때문에의 호출 cuticular 판에서 연장 stereociliary 번들 각 감각 헤어 셀 (11)의 (선 단면). mechanosensation 및 stereocilia 그들의 명칭에도 불구하고 차 트랜스 듀서로서 이러한 행위는 실제로 수정 액틴 필라멘트 기반의 미세 융모로 구성된다. 각 갈매기 모양의 머리 내 번들은, stereocilia의 세 행이 높은 주문 및 일반 PA로 구성됩니다계단 경우와 같은 방식으로 ttern. 리얼 미세 소관 기반 섬모가 되나 kinocilia는 stereociliary 번들 (12)의 발전 방향에 대해 요구된다. 각 머리 셀에, 하나의 kinocilium 물리적 stereocilia의 가장 높은 행 중앙에 인접하여 위치, stereocilia 번들에 부착된다. kinocilium의 정확한 기능은 명확하지 않다, 하나의 가설은 미세 융모 (12)로부터 성숙 kinocilium 모양으로 stereocilia를 '당겨'이다. 척추 동물에서, 달팽이관에 kinocilia은 일시적으로 만 존재하고 11,13,14 청각의 발병하기 전에 쥐의 유모 세포에서 후퇴.심각하게 단축 인공 와우 덕트의 개발 달팽이관 결과에 섬모의 전체 손실, 잘못을 형성하고 stereociliary 번들뿐만 아니라 잘못된 위치에 기초 몸 8,9 잘못이 지향. 기능 섬모는 단지 섬모 axoneme 구성되어 있지 않습니다. 섬모와 관련된 많은 단백질기능은 기초 신체, 전이 영역, 또는 섬모 axoneme 15 섬모 관련 하위 도메인에 지역화 단지에서 발생합니다. 중심체의 어머니 중심 소체에서 파생 된 기저 몸은 또한 세포체로 떨어져 섬모에서 연장 미세 소관에 대한 미세 소관 조직화 센터 및 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 섬모 인신 매매를 규제 할 수 있습니다. 섬모 전이 영역은 섬모 기능이 섬모 화합물 (16)의 가져 오기 및 내보내기를 조직의 관점에서 규제되고 또 다른 영역이다.
정확한 메커니즘은 명확하지 않지만 17 여러 연구는 섬모 및 비표준의 Wnt (PCP 신호) 사이의 연결을 확인 하였다. 섬모와 PCP 유전자의 중복과 일반 세포의 이상으로 세포 극성의 감도, 어려운 직접 PCP 별 적자에 돌연변이를 링크 할 수 있습니다. PCP 시그널링 리드 아웃 중 하나가 기부 본체와 PRIMAR의 포지셔닝y를 섬모 따라서 보조 결함 차를 분리하는 도전이다. 제브라 피쉬와 마우스 돌연변이의 일부 연구는 18 ~ 20 신호 섬모와의 Wnt 사이에 연결을 제안 없었다. 데이터의 불일치 종, 조직, 또는 Wnt 신호으로 섬모 기여금 시간에 의존하는 차이를 반영 할 수있다. 기초 몸은 기능을 유지하는 경우 또한, 정상의 Wnt 응답 성이 유지 될 수 있습니다. 세포 신호 전달 경로와 다른 생물학적 현상의 섬모 단백질의 역할에 대한 깊은 통찰력 우리 세포 및 발생 생물학 이해뿐만 아니라 표적 치료 전략의 개발이 매우 중요하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
분석을 위해 인공 조직을 준비 할 때, 명심 할 몇 가지 주요 사항이 있습니다. 우선, 유전 적 배경 차이는 필요한 분석에만 한배 새끼 컨트롤과 비교하게 인공 표현형을 수정할 수있다. 둘째, tectorial 막의 완전한 제거는 면역 조직 화학 최상의 이미지를 얻기 위해 필요한 및 SEM을 위해 필수적이다. tectorial 막은 불투명 한 구조 및 이미지가 더 도전하고, 그 아래에 직접 감각 상피의 세포를 모호하게 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고들의 중요한 평가 매튜 켈리, 티지 아나 Cogliati, 제시카 Gumerson, 우베 Wolfrum, Rivka Levron, 비올라 KRETSCHMER와 조이 맨을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Sofja Kovalevskaya에 상 (Humbodlt 재단)와 요하네스 구텐베르크 대학, 마인츠, 독일에 의해 투자되었다.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |
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