Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Résumé

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Résumé

L’organe de Corti, logé dans la cochlée de l’oreille interne, contient des cellules ciliées mécanosensorielles et des cellules de soutien environnantes qui sont organisées en forme de spirale et ont un gradient tonotopique pour la détection des sons. La cochlée de la souris mesure environ 6 mm de long et est souvent divisée en trois tours (apex, milieu et base) pour l’analyse. Pour étudier la perte cellulaire, la division cellulaire ou l’expression génique en mosaïque, l’ensemble du montage ou de la préparation de surface de la cochlée est utile. Cette méthode de dissection permet de visualiser toutes les cellules de l’organe de Corti lorsqu’elle est combinée à l’immunomarquage et à la microscopie confocale pour imager les cellules à différents plans de l’axe z. Plusieurs sections efficaces optiques peuvent également être obtenues à partir de ces images de la pile z. De plus, la méthode de dissection complète peut être utilisée pour la microscopie électronique à balayage, bien qu’une méthode de fixation différente soit nécessaire. Ici, nous présentons une méthode pour isoler l’organe de Corti en trois tours cochléaires intacts (apex, milieu et base). Cette méthode peut être utilisée pour des souris âgées d’une semaine à l’âge adulte et diffère de la technique utilisée pour les échantillons néonatals où la calcification de la cochlée est incomplète. Une version légèrement modifiée peut être utilisée pour la dissection de la cochlée du rat. Nous faisons également la démonstration d’une procédure d’immunomarquage avec des anticorps marqués par fluorescence.

Introduction

La cochlée en forme de spirale de l'oreille interne, contenue dans l'os temporal, abrite l'organe de Corti, la sensibilité auditive organe final chez les mammifères. La cochlée est tonotopically organisé et souvent divisé en apicale, un milieu et basale tours correspondant à différentes régions de fréquence avec détection de son à haute fréquence dans la base et la détection de basse fréquence dans l'apex ^1. Les cellules ciliées, les cellules mécano de l'organe de Corti, courent tout le long de la cochlée, qui est d'environ 6 mm de long chez la souris ^2,3. Ces cellules convertissent l'énergie mécanique des ondes sonor....

Protocole

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à l'École de médecine de l'Université Southern Illinois.

1. Extraction des temporelles Bones

1. Identifier les os temporaux dans la base du crâne de la souris ^{13 et} gratter les nerfs crâniens aide de pinces de modèle standard.
2. Placez la pince de modèle standard à la pointe de la capsule otique et avec le pouce de la presse à main opposée sur le canal semi-circulaire postérieur pour déloger la cochlée encapsulé.
3. Libérez la moitié inférieure de l'os....

Résultats

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti que trois tours intactes cochléaires (de sommet, milieu, et la base) à partir de tissu cochléaire qui est calcifiée, avec des étapes de dissection clés présentés dans la figure 1. Pendant la première semaine postnatale du développement, la calcification de la cochlée de souris est incomplète et une méthode de dissection plus simple peut être utilisé ^13. En utilisant la méthode de di.......

Discussion

Il ya plusieurs étapes cruciales pour la réussite de toute la dissection de montage et immunologique. Cependant, avant l'une de ces méthodes sont exécutées, fixation appropriée du tissu cochléaire est nécessaire. Nous vous recommandons d'utiliser le méthanol libre, ultra-pure, de qualité EM PFA. PFA fait à partir de poudre peut avoir des traces de méthanol et un pH instable qui diminue la qualité de l'immunofluorescence. D'autres groupes ont également montré que les dissections similaires sont poss.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince à motif standard	Les outils de science fine	11000-12	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs
Ciseaux fins de 10,5 cm	Outils de science fine	14060-11	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs
Tubes de microcentrifugation de 2 ml	MidSci	AVSS2000	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs 16
% de formaldéhyde, sans méthanol, ultra pur, grade	EM Polysciences	18814	TOXIQUE --Portez des gants et ne pouvez pas être jeté dans l’évier. Peut être acheté auprès d’autres vendeurs.  ;
PBS pH 7,4	Sigma	P3813-10PAK	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
EDTA	Fisher	BP118-500	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Rotateur de tube bout à bout	Fisher	05-450-127	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Boîte de
Pétri de 60 mm	Fisher	50-202-037	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Kit d’encapsulation
en silicone Dow Corning Sylgard 184	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
actif	Fisher	AC134372500	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
dissection stéréo	Zeiss	Stemi 2000	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Dumont #4 pince de bijoutier	Outils de science fine	11241-30
Dumont #5 pince de bijoutier	Outils de science fine	11251-20
Ciseaux à ressort Vannas de 2,5 mm	Outils de science fine	15001-08	courbés.
Ciseaux à ressort Vannas-Tübingen de 5 mm	Fine Science Tools	15003-08	plaques droites
48 puits	Fisher	08-772-52	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs
Diapositives à chambre à 8 puits	Fisher	1256518	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs
Triton X-100	Sigma	X100-500	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
NGS	Vector labs	S-1000	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
NHS	Vector labs	S-2000	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Rotateur 3D	Midsci	R3D-710	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Boîte d’incubation Western blot XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Les
supports de montage anti-effacement Prolong gold	Life Technologies	P36930	peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs, mais les supports de montage varient dans leur capacité à protéger contre le photoblanchiment
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs lamelles de
protection 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs vernis à
ongles transparent	Drugstore		local peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Chemise à
lames en carton	Fisher	12-587-10	peut être achetée auprès d’autres fournisseurs
Boîte à lames en plastique	Fisher	03-448-10	peut être achetée auprès d’autres fournisseurs

charbon microscope à à