पूरा पर्वत विच्छेदन और वयस्क माउस कोक्लीअ के immunofluorescence
Summary
हम तीन बरकरार कर्णावत बदल जाता है (एपेक्स, मध्य, और आधार) के रूप में कोर्टी वयस्क अंग को अलग-थलग करने के लिए एक तरीका मौजूद है। हम यह भी fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ immunostaining के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन। एक साथ इन तकनीकों कोक्लीअ में पाया बालों की कोशिकाओं, समर्थन कोशिकाओं, और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
लौकिक हड्डी के भीतर निहित भीतरी कान की सर्पिल के आकार कोक्लीअ, कोर्टी, स्तनधारियों में श्रवण संवेदी अंत अंग का अंग घरों। कोक्लीअ tonotopically का आयोजन किया है और आमतौर पर शिखर, मध्य में बांटा गया है, और बेसल सुप्रीम 1 में आधार और कम आवृत्ति का पता लगाने में उच्च आवृत्ति ध्वनि पता लगाने के साथ अलग आवृत्ति क्षेत्रों के लिए इसी बदल जाता है। बालों की कोशिकाओं, Corti के अंग के mechanosensory कोशिकाओं, चूहों 2,3 में लगभग 6 मिमी लंबी है जो कोक्लीअ की लंबाई चलाते हैं। इन कोशिकाओं को केंद्रीय श्रवण संरचनाओं द्वारा कार्रवाई की जाती है कि तंत्रिका संकेतों में, तरल पदार्थ से भरे झिल्लीदार भूलभुलैया के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं, जो ध्वनि तरंगों के यांत्रिक ऊर्जा में परिवर्तित। यहाँ वर्णित तकनीक (उम्र के एक सप्ताह से वयस्कता को लेकर नमूने के लिए) कोक्लीअ का कड़ा हो जाना के बाद Corti के अंग के पूरे आरोह को तैयार करने के लिए एक विधि के पूरा हो गया है प्रदान करता है। हम यह भी immunosta के लिए एक तरीका मौजूद हैपूरे ining कर्णावत ऊतक मुहिम शुरू की। कर्णावत पूरे mounts सभी बाल कोशिकाओं के दृश्य और उनके प्राकृतिक स्थानिक व्यवस्था में समर्थन कोशिकाओं के आसपास के लिए महत्वपूर्ण हैं और confocal माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ तीन आयामों में विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं।
डीआरएस। हंस Engstrom और हार्लो Ades मूल रूप से वे तेजी से सूक्ष्म विश्लेषण 4 के लिए Corti के अंग से कम बरकरार खंडों संरक्षण, ठीक करने और स्तनधारियों की एक किस्म से तरल में डूबे हुए calcified cochleae काटना करने के लिए एक तकनीक विस्तृत 1966 में एक पूरे माउंट कर्णावत विच्छेदन विधि का वर्णन किया। एक unfixed, calcified चूहे कोक्लीअ के विच्छेदन भी एक अनुदेशात्मक वीडियो 5 में सचित्र कर दिया गया है। डीआरएस। बारबरा Bohne और वाशिंगटन विश्वविद्यालय के गैरी हार्डिंग इस विधि के लिए कई महत्वपूर्ण संशोधन किए गए। कर्णावत पूरे माउंट विधि के अपने संस्करण में, लौकिक हड्डी, decalcified था प्लास्टिक में एम्बेडेड, और पांच आधा बदल जाता है या दस क्वार्टर बदल जाता है dissec थेटेड 6.7। कि प्लास्टिक एम्बेडिंग 8 की आवश्यकता नहीं थी इसलिए डॉ चार्ल्स Liberman और Eaton पीबॉडी प्रयोगशालाओं, मैसाचुसेट्स आँख और कान दुर्बलता में सहयोगियों, इस तकनीक को संशोधित। तकनीक के आगे संशोधन यहाँ प्रस्तुत विच्छेदन विधि सूचित जो सेंट जूड बच्चों अनुसंधान अस्पताल 9-12 पर डॉ जियान Zuo की लैब में हुई। हम पूरा शिखर, मध्य, और बेसल बदल जाता है की अलगाव की अनुमति देता है जो Bohne और Liberman से कोर्टी के अंग के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए एक अलग रणनीति का उपयोग करें। इस प्रकार विच्छेदित ऊतक बड़ा और विच्छेदन या immunostaining प्रक्रिया के दौरान खो दिया है या क्षतिग्रस्त होने की संभावना कम होती है। इसके अलावा, मौजूदा विधि शिखर टिप या एक आवृत्ति क्षेत्र की पहचान करने के लिए बेसल हुक से दूरी की माप की सुविधा।
कई प्रयोगशालाओं कर्णावत ऊतक के immunostaining प्रदर्शन हालांकि इस विधि शुरु हुआ है, जहां यह स्पष्ट नहीं है। नतीजतन buffe रोकने के लिए विभिन्न व्यंजनों देखते हैंरुपये और व्यक्तिगत प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है कि एंटीबॉडी ऊष्मायन बफ़र्स। यहाँ, हम श्रवण क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए लागू है कि fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ immunostaining के लिए एक तरीका मौजूद है।
कोक्लीअ के जटिल आकार, Corti के अंग के नाजुक संरचना, और बोनी झालर ऊतकीय और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक चुनौती प्रदान करते हैं। तकनीक की एक किस्म वर्तमान में इन कठिन सुविधाओं से जूझना पड़ा और कोर्टी, अपने फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक तकनीक के अंग के भीतर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए सुनवाई के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मामूली संशोधन के साथ, संभावित क्षेत्र में इस्तेमाल अन्य मॉडल जीवों की विविधता से cochleae भीतर महत्वपूर्ण संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वयस्क माउस कोक्लीअ के पूरे माउंट विच्छेदन के लिए अनुमति देता है और।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफल पूरे माउंट विच्छेदन और immunostaining के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इन विधियों का भी प्रदर्शन कर रहे हैं हालांकि इससे पहले, कर्णावत ऊतक के उचित निर्धारण की जरूरत है। हम मेथनॉल मुक्त, अति शुद्ध, ईएम ग्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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