En ELISA binde- og konkurranse Metode for å raskt bestemme ligand-reseptor interaksjoner
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
En omfattende forståelse av signalveier krever detaljert kunnskap om den ligand-reseptor-interaksjon. De fleste metoder for å vurdere interaksjonen av en spesiell ligand med dets spesifikke reseptor er kostbare, tidkrevende, arbeidskrevende og krever spesielt utstyr og ekspertise en.
Denne artikkelen beskriver to raske og pålitelige punkt-for-punkt-protokoller for å undersøke den ligand-reseptor-interaksjon basert på en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA): den direkte ligand-reseptor-interaksjon assay (LRA) og konkurransen LRA. ELISA er en svært følsom, spesifikk og lett tilgjengelig teknikk, som rutinemessig brukes i nesten alle laboratorier. ELISA kan utføres og tilpasses i ulike moter. De presenterte protokoller er optimalisert for etterforskningen av samspillet mellom ulike lambda interferoner (INFLs) og deres reseptor.
Den direkte LRA gjør det mulig for en quantificatipå av ligand-reseptor-binding i forhold til ligandkonsentrasjonen og således gir en bindingskurve. Ved hjelp av en egnet modell for den ligand-reseptor-interaksjon, kan dataene bli ytterligere analysert for å beregne dissosiasjonskonstanten (KD).
I den fremlagte protokoll, blir det ofte brukt Hill ligning anvendes for å modellere den ligand-reseptor-binding. Selv om andre metoder som for eksempel overflate-plasmonresonans teknologi 2,3 tillate bestemmelsen av bindingsaffinitetene mellom to proteinene, er denne teknologien ofte arbeidskrevende, kostbare og krever spesiallaboratorieutstyr.
Konkurransen LRA muliggjør screening av inhibitoriske peptider: den ligand-reseptor-binding ble kvantifisert med hensyn til peptid-konsentrasjon. Dette gir en dose-responskurve som beskriver den hemmende effekten av peptidet. Dataene kan bli ytterligere analysert for å estimere halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50 </sub>) av sperre peptidet.
Begge ELISA protokoller er enkle å bruke og kan tilpasses et bredt spekter av problemstillinger. Rekombinante proteiner av noe slag kan anvendes for å sikkert og raskt bestemme interaksjons delene. I tillegg kan konkurransen LRA brukes til å bestemme kritiske interaksjons områder av ligander og reseptorer ved hjelp av blokkerende peptider, som er utformet for å etterligne enten liganden eller reseptoren. Dersom blokkerende peptidet viser effektiv og spesifikk hemming, opptar peptidet et kritisk område interaksjon av liganden (dersom peptid-etterligner reseptor) eller av liganden (dersom peptid-etterligner ligand).
Den første protokollen beskriver K-D-verdien bestemmelse av forskjellige INFLs og alfa-underenhet av sin reseptor, dvs. det interleukin-28-reseptor (IL28RA) ved hjelp av direkte LRA. Deretter viser den andre protokollen hvordan å bestemme evnen til en 20 aminosyre lange peptidethemme infl-IL28RA interaksjoner. Peptidet er utformet for å konkurrere med IFNLs ved deres reseptor-bindingssete, og muliggjør således en molekylær forståelse av interaksjonen. Videre kan dette peptid bli brukt til å blokkere IL28RA i in vitro forsøk for å bestemme virkningen på nedstrøms signaliseringseffekter 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA er en standard og veletablert metode i mange laboratorier. Vi har ytterligere modifisert og forbedret en tidligere publisert metode 5,7. Den viste trinn-for-trinn-protokollen viser hvordan den kan brukes på en enkel måte å bestemme K-D-verdiene av ligand-reseptorinteraksjoner. I tillegg kan IC50 av en blokkerende peptid som griper inn i ligand-reseptor-interaksjon bestemmes.
Store fordeler er den raske oppsett, enkel tilberedning av reagenser og kjent håndteri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O’Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
