Un ELISA à base de liaison et la méthode de la concurrence de déterminer rapidement interactions ligand-récepteur
Summary
The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.
Abstract
A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.
Introduction
Une compréhension approfondie des voies de signalisation nécessite des connaissances détaillées sur l'interaction ligand-récepteur. La plupart des méthodes d'évaluation de l'interaction d'un ligand particulier avec son récepteur spécifique sont chers, beaucoup de temps, de main – d'œuvre et nécessitent des équipements et de l' expertise 1 spécifique.
Cet article décrit deux protocoles rapides et fiables point par point pour étudier l'interaction ligand-récepteur basé sur une enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): le ligand-récepteur directe interaction dosage (LRA) et la LRA de la concurrence. ELISA est une technique très sensible, spécifique et facilement disponibles, couramment utilisés dans presque tous les laboratoires. ELISA peut être réalisée et adaptée de diverses façons. Les protocoles présentés sont optimisés pour l'étude de l'interaction entre les différents interférons lambda (de INFLs) et leur récepteur.
La LRA directe permet une quantificatile ligand de liaison au récepteur par rapport à la concentration de ligand et on obtient ainsi une courbe de liaison. En utilisant un modèle approprié pour l'interaction ligand-récepteur, les données peuvent être analysées pour estimer la constante de dissociation (K D).
Dans le protocole présenté, l'équation de Hill couramment utilisée est appliquée au modèle de la liaison ligand-récepteur. Bien que d' autres méthodes telles que la technologie de résonance plasmonique de surface 2,3 permettent de déterminer les affinités de liaison entre les deux protéines, cette technologie est souvent un travail intensif, coûteux et nécessite un équipement de laboratoire spécial.
La LRA de la concurrence permet le criblage de peptides inhibiteurs: La liaison ligand-récepteur est quantifiée par rapport à la concentration de peptide. On obtient ainsi une courbe dose-réponse décrivant l'effet inhibiteur du peptide. Les données peuvent être analysées pour estimer la concentration inhibitrice à demi maximale (IC50 </sub>) du peptide de blocage.
Les deux protocoles ELISA sont faciles à utiliser et peuvent être adaptés à un large éventail de questions de recherche. Les protéines recombinantes de toute nature peuvent être utilisés pour déterminer de manière fiable et rapide des pièces d'interaction. En outre, la LRA de la compétition peut être utilisée pour déterminer des sites d'interaction critiques des ligands et des récepteurs en utilisant des peptides de blocage, qui sont conçus pour simuler le ligand ou le récepteur. Si le peptide bloquant montre l'inhibition efficace et spécifique, le peptide occupe un site critique de l'interaction du ligand (si le peptide imite le récepteur) ou du ligand (si le peptide imite le ligand).
Le premier protocole décrit la détermination de la valeur K D de différents INFLs et la sous – unité alpha de leur récepteur, soit le récepteur de l' interleukine-28 (IL28RA) en utilisant la LRT directe. Ensuite, le second protocole indique comment déterminer la capacité d'un peptide long de 20 acides aminés àinhiber les interactions Infl-IL28RA. Le peptide a été conçu pour rivaliser avec IFNLs à leur site de liaison du récepteur et permet ainsi une bonne compréhension de l'interaction moléculaire. En outre, ce peptide peut être utilisé pour bloquer IL28RA dans des expériences in vitro pour déterminer l'impact sur les effets de signalisation en aval 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA est une norme et une méthode bien établie pour de nombreux laboratoires. Nous avons en outre modifié et amélioré une méthode publiée précédemment 5,7. Le protocole montré étape par étape montre comment il peut être utilisé d'une manière simple pour déterminer les valeurs Kd interactions ligand-récepteur. En outre, la CI50 d'un peptide de blocage qui interfère avec l'interaction ligand-récepteur peut être déterminée.
Les principaux…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich and Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Switzerland) for his critical review of the manuscript.
Materials
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6X His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA – TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 – Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
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