Article de méthode

Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels

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DOI :

10.3791/53578

⸱

12 février 2016

 ,  , 
1Department of Surgery - Division of General Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Chemical Engineering, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Une technique de biofabrication innovante a été développée pour concevoir des constructions tridimensionnelles qui ressemblent aux caractéristiques architecturales, aux composants et aux propriétés mécaniques des tissus in vivo. Cette technique fait appel à un matériau sacrificiel nouvellement développé, le caoutchouc BSA, qui transfère des caractéristiques spatiales détaillées, reproduisant les architectures in vivo d’une grande variété de tissus.

Résumé

échafaudages tissulaires jouent un rôle crucial dans le processus de régénération des tissus. L'échafaudage idéal doit répondre à plusieurs exigences comme ayant une composition appropriée, module ciblé, et les caractéristiques architecturales bien définis. Biomatériaux qui récapitulent l'architecture intrinsèque des tissus in vivo sont vitales pour l'étude des maladies ainsi que pour faciliter la régénération des tissus mous perdus et mal formé. Une technique de biofabrication roman a été développé qui combine l'état de l'imagerie de l'art, l'impression en trois dimensions (3D), et l'activité enzymatique sélective pour créer une nouvelle génération de biomatériaux pour la recherche et l'application clinique. Le matériau développé, caoutchouc sérum-albumine bovine, est une réaction injectée dans un moule qui respecte les caractéristiques géométriques spécifiques. Ce matériau sacrificiel permet le transfert adéquat d'éléments architecturaux à un matériau d'échafaudage naturel. Le prototype se compose d'un échafaudage de collagène 3D avec 4 et 3 canaux mm que des reprESENT une architecture ramifiée. Ce document met l'accent sur l'utilisation de cette technique de biofabrication pour la production de produits d'assemblage physiques. Ce protocole utilise un logiciel assistée par ordinateur (CAO) pour fabriquer un moule solide qui sera injecté avec du caoutchouc réaction de BSA, suivi par la digestion enzymatique de la gomme, en laissant ses caractéristiques architecturales au sein du matériau d'échafaudage.

Introduction

Dans le domaine de l'ingénierie tissulaire de la capacité de fabriquer des échafaudages tissulaires est essentiel. Un échafaudage pour tissu approprié présente une structure 3D, est composée de matériaux biocompatibles, et imite l'architecture tissulaire in vivo afin de faciliter la croissance et le remodelage cellulaire et tissulaire. Cet échafaudage doit permettre le transport des nutriments et l'élimination des déchets 1-4. L'un des principaux obstacles à la production de ces échafaudages est la capacité de récapituler les caractéristiques géométriques spécifiques dans un matériau biocompatible. Plusieurs techniques de Biofabrication ont été rapportés pour contrôler les caractéristiques géométriques de ces échafaudages, des exemples sont électrofilage 5-8, solvant sous pression 9, 10 stéréolithographie, et l'impression 3D-11, entre autres. Ces techniques ne répondent pas à fournir un transfert relativement facile de caractéristiques architecturales internes et externes contrôlables, sont coûteux, sont limités par leur résolution et l'imprimabilité ( par exemple, une jauge de buse, la restriction de la matière), ou nécessitent des techniques de post-fabrication qui exige une longue période de temps pour produire des échafaudages viables 12.

Dans de nombreux systèmes de fabrication commerciale, la création de vides internes, des canaux et des caractéristiques est obtenue en utilisant du sable ou d'autres matériaux amovibles ou sacrificiels appropriés. La pièce métallique ou en matière plastique est formée autour du moule en sable, et une fois qu'elle est solidifiée, le sable est éliminé. De la même manière, la prochaine génération de biomatériaux a besoin de l'équivalent biosable. Par conséquent, le caoutchouc BSA a été développé comme un substitut à biosable. Le caoutchouc est un matériau BSA nouvelle formule qui consiste en l'albumine de sérum bovin réticulé avec du glutaraldéhyde. Le but ultime est de recréer les caractéristiques architecturales spécifiques dans un échafaudage de collagène biodégradable. Les caractéristiques du biorubber sacrificielle qui maintient fidélité dimensionnelle avec le moule d'origine du tissu sont décrits.

Plusieurs combinaisons de concentrations de glutaraldéhyde et de BSA ont été testés en utilisant une variété de solvants. Ce matériau a été réalisé par la réaction entre BSA et le glutaraldéhyde. BSA caoutchouc réaction peut être injecté dans les géométries complexes des moules de tissus. BSA est la trypsine réticulé labile et facilement digéré par l'enzyme dans des conditions de pH et de températures douces. A l'inverse, le type intacte collagène est très résistant à la digestion par la trypsine. Ces caractéristiques ont été capitalisés pour éliminer sélectivement le caoutchouc de BSA laissant le collagène derrière. Le présent travail a consisté à déterminer les paramètres idéaux nécessaires pour obtenir un moule labile qui peut fournir des caractéristiques architecturales spécifiques à un échafaudage biocompatible. Les caractéristiques spécifiques qui ont été évalués inclus miscibilité, digestion par une enzyme, porteur, et sa capacité à être la réaction injecté dans un moule négatif. La combinaison de 30% de BSA et 3% de glutaraldéhyde répond à ces exigences. Ce protocole prévoit la nécesary instructions pour créer ces échafaudages tridimensionnels. Le prototype est constitué d'un échafaudage de collagène qui représente une architecture ramifié avec une entrée et deux sorties de canal ayant des diamètres de 4 et 3 mm, respectivement. Cette technique a le potentiel pour imiter macro- et des micro-environnements du tissu d'intérêt. Cette technologie offre une technique adéquate pour fournir un instructive géométrique spécifique à un matériau biodégradable en quelques relativement facile et rapide avec une grande fidélité, qui peut être réglé pour imiter l'élasticité vivo dans des tissus et d'autres caractéristiques du tissu d'intérêt.

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Protocole

1. Déterminer le pourcentage de solides dans le Lot collagène

  1. Extraire le collagène suivant une procédure déjà publié 13. Décongeler un minimum de 20 ml de collagène. Déterminer le pourcentage de matière sèche initiale de collagène dans le lot dans le but de manipuler la concentration de collagène dans les hydrogels formés.
    1. Couper trois morceaux de feuille d'aluminium (environ 6 x 6 cm) et la forme de chacun comme une casserole en utilisant le fond d'un bêcher de 25 ml. Noter le poids de chaque moule.
    2. Ajouter une petite quantité de collagène pour chaque moule et noter le poids total de la casserole d'aluminium et de collagène. Ajouter 0,5 à 0,8 g de collagène sur chaque pan de l'aluminium.
      Remarque: Après cette étape, il y a trois casseroles de feuille d'aluminium et chacun devrait avoir une petite quantité de collagène. Assurez-vous d'enregistrer le poids de chaque (total 3) en aluminium casserole vide et le poids de la casserole après l'addition de collagène.
    3. Calculer le poids du collagène dans chaque moule à l'aide du fuite à la formule:
      poids de collagène = Pan et le poids de collagène - poids Pan
    4. Placer trois des cuvettes en aluminium qui contiennent du collagène à l'étuve à 100 ° C pendant 24 heures.
    5. Après 24 heures, enregistrer le poids de chaque pan de l'aluminium et le collagène déshydraté.
    6. Calculer le poids du collagène déshydraté en utilisant l'équation suivante:
      Déshydraté poids de collagène = Pan et le poids de collagène déshydraté - poids Pan
    7. Calculer le pourcentage de solides pour les trois échantillons pour déterminer la concentration en matières solides de collagène en utilisant la formule ci-dessous:
      figure-protocol-1
    8. Calculer la teneur en matières solides de collagène moyenne du lot en utilisant le pourcentage de matières solides de collagène pour chacun des trois échantillons.
      Remarque: Le collagène qui sera utilisé est ce qui reste du collagène hydraté. Aucune de ces collagène déshydraté est utilisé.
    9. Après avoir déterminé le pourcentage de collagène solide (ipréside d'abord la concentration de collagène) de la charge, continuer à utiliser le collagène hydraté restant. En utilisant un pH-mètre étalonné pour ajuster le pH du mélange de collagène à 3.
      1. Ajouter de petites quantités (2-5 pi à la fois) de 12 N d'acide chlorhydrique (HCl). Garder sur la glace en tout temps. Ne pas ajouter l'acide chlorhydrique directement au collagène - ajouter l'acide à la paroi du tube. Après addition de l'acide, en utilisant la spatule pour pousser l'acide au collagène et le mélange est agité rapidement.
    10. Une fois qu'il atteint un pH de 3, que le collagène asseoir O / N à 4 ° C.

2. Préparation de la BSA en caoutchouc

  1. Préparer la solution de sérum-albumine bovine (BSA) en suivant la procédure ci-dessous.
    1. Préparer la solution 2x tampon phosphate salin (PBS). Ajouter deux comprimés PBS à 100 ml d'eau pour faire 0,02 M solution PBS.
    2. Combiner avec 2x PBS BSA pour créer une solution de BSA à 30% en utilisant la procédure ci-dessous.
      1. Par exemple, pour effectuer une BSA de 30% par 30 ml de 2x PBS, en utilisant 12,9 g de BSA. Ajouter 1/3 de la 2x PBS (par exemple, 10 ml) dans un ballon avec une barre d'agitation. Ajouter 1/2 de la BSA (par exemple, BSA 6,45 g) dans le ballon et à l'aide d'une spatule, mouillant le soluté sec.
      2. Répéter ce procédé consistant à ajouter du PBS puis BSA jusqu'à ce que le soluté et le solvant est contenu dans le ballon. Utilisez la spatule pour mouiller tout le soluté. Il ressemble à un mélange d'un peu de liquide et de bouquets. Laisser reposer pendant environ 30 min.
      3. Ensuite, tourner l'agitateur sur un cycle bas et assurez-vous qu'il n'y a pas touffes autour de la barre d'agitation. Il devrait prendre 90 minutes pour arriver tout en solution ou il peut être laissé sous agitation O / N à 4 ° C. Après tout le soluté est dissous, placer la solution dans une seringue de 20 ml et coiffée d'un filtre à seringue de 0,20 um. Appuyez sur le piston pour expulser le liquide à travers le filtre et de recueillir la solution stérilisée dans un nouveau tube. Conserver à 4 ° C.
    3. Préparer 3% soluti de glutaraldéhydepar dilution de la solution de glutaraldéhyde à 25% à une filtration stérile PBS 2x. Par exemple, pour 10 ml de solution de glutaraldéhyde à 3%, en utilisant 2 ml de glutaraldéhyde à 25% et 8 ml de 2x PBS. Conserver à 4 ° C.

3. Traitement Moules

Remarque: Le prototype décrit dans ce document utilise un acier inoxydable Y pièce moulée sur mesure. Le moule contient une entrée et deux canaux d'écoulement de 4 mm et 3, respectivement. Tout d'abord, moules propres, les pulvériser avec du saindoux insaturé, et les stériliser. Préparer les moules suivant le mode opératoire décrit ci-dessous.

  1. Nettoyer les moules en acier inoxydable à l'aide de sonication à une fréquence de 35 kHz. Placer les moules dans l'appareil à ultrasons et les submerger avec de l'eau et de la glace. Gardez les moules à froid en tout temps pendant l'appareil à ultrasons est en marche. Exécutez le sonicateur pendant 2 périodes de 90 min.
    1. Après chaque période, utilisez une aiguille pour faire en sorte qu'il n'y a pas matière dans le luer lock acier inoxydable ou bconnecteur rass. Utilisez de l'eau et du savon pour nettoyer toute la surface des deux côtés des moules. Vérifiez qu'il n'y a pas d'obstruction dans les canaux.
  2. Placer le moule, les vis et le connecteur de verrouillage Luer dans un sac d'autoclave et on.
  3. Remplir la bouteille qui se fixe à un mi-chemin de pulvérisateur à air avec du saindoux disponible dans le commerce (acide gras libération de l'agent mixte). Remplacer le bouchon d'une bouteille de plafonnement régulière. Placez-le dans un sac en autoclave et elle.
    Remarque: Lard est utilisé pour faciliter la libération de la matière qui sera la réaction injecté plus tard (en caoutchouc BSA). Ne pas placer le couvercle pulvérisateur de la bouteille dans le un autoclave, il peut endommager le joint interne.
  4. Faire chauffer le saindoux pendant 45 secondes ou jusqu'à ce que son clair et liquide dans un micro-ondes. Vissez le couvercle du pulvérisateur d'air à la bouteille de saindoux. Branchez le couvercle avec le pulvérisateur. Attelez le pulvérisateur à la source d'air à la table de laboratoire. Ouvrez la vanne d'air, et d'ouvrir la buse du pulvérisateur jusqu'à ce qu'il commence mouillage de la surfaced'une serviette en papier.
  5. Pulvériser le saindoux perpendiculaire à la surface du moule jusqu'à ce que la surface est entièrement couverte. Après chaque morceau a été pulvérisé, les placer dans une boîte de Pétri et la scelle. Placer les moules à 4 ° C pendant 2 heures.
  6. Procéder à stériliser les moules en exposant la surface à la lumière UV pendant 30 minutes. Placez-les revenir à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être injecté réaction.

4. Reaction Injection de la BSA en caoutchouc

Remarque: Tous les matériaux et les solutions doivent être garder froid jusqu'au moment de servir pour éviter un durcissement prématuré du caoutchouc BSA dans les prochaines étapes.

  1. Préparer le distributeur pour fournir le caoutchouc BSA aux moules suivant ces étapes.
    1. Stériliser tous les composants de mélange (deux O de bagues, capuchon de la seringue, double seringue, pointe mélanger, et 4: 1 distributeur) en les exposant à la lumière UV pendant 30 min dans le capot de réaction en chaîne par polymérase (PCR).
      Remarque: Une hotte PCR a été utilisé parce que tsa procédure implique fixateurs. Ces produits ne peuvent être utilisés dans la cellule / tissu culture capot en raison du risque d'exposition et la toxicité pour les cellules. Toute autre capot qui contient une lumière UV sera adapté.
    2. Placez le capuchon sur le support de la solution.
    3. Effectuer le mélange et l'injection à un ratio de 4: 1 de BSA: Glutaraldéhyde. Ajouter 30% de BSA à la chambre de double seringue qui offrira la plus grande quantité de solution (Il faudra environ 4 ml à remplir). Assurez-vous de laisser suffisamment d'espace pour placer le joint torique afin d'éviter la contamination débordante et de la chambre adjacente.
    4. Ajouter une solution de glutaraldéhyde à 3% à l'autre chambre (il faudra environ 1 ml à remplir). Assurez-vous de laisser suffisamment d'espace pour placer le joint torique pour empêcher la contamination débordante et de la chambre adjacente.
    5. Placez la double seringue sur le distributeur. Inclinez l'ensemble verticalement de sorte que le capuchon de la seringue est sur le dessus. Remplacer le bouchon avec l'embout mélangeur.
    6. Caroline du SudRew les deux parties de moule en acier inoxydable ensemble.
    7. Placez l'ensemble à l'intérieur d'un sac en autoclave.
    8. Pour enlever l'air dans le distributeur, le maintenir en position verticale et rapidement appuyez sur la poignée d'un temps de libérer une petite quantité de la BSA mélangé avec le glutaraldéhyde. Ensuite, fixez rapidement Luer le connecteur de verrouillage de l'acier inoxydable Y moule à la pointe de la seringue.
    9. Tenez le moule inoxydable acier Y avec la main gauche et le mélange distributeur BSA-glutaraldéhyde sur la droite. Alternate couvrant chacun des gaz d'échappement à gauche et à droite des canaux d'écoulement en appuyant sur les gaz d'échappement sur les côtés du sac en autoclave pour assurer que les vides à l'intérieur sont remplis de solution. Ensuite, placez les moules horizontalement et injecter à nouveau.
    10. Détachez les moules de distributeur et placer dans un plat de 25 mm de Pétri.
    11. Parafilm placer autour de la boîte de Petri pour prévenir la déshydratation du caoutchouc.
    12. Placez le moule dans le 4 ° C réfrigérateur O / N.

5. Ajuster la concentration de collagène

Remarque: Le collagène doit être conservé dans la glace en tout temps au cours du processus.

  1. Modifier la concentration de collagène en utilisant le pourcentage de matières solides de collagène.
    1. Faire 10 ml de 1,75% de collagène en ajustant la concentration initiale de collagène avec de l'eau froide.
    2. En utilisant un pH-mètre étalonné, ajuster le pH à 3 en utilisant 12 de l'acide chlorhydrique. Ne pas ajouter l'acide chlorhydrique directement au collagène ajouter l'acide à la paroi du tube. Après addition de l'acide, utiliser la spatule pour pousser l'acide dans le collagène et rapidement agiter le mélange.
    3. Peser 4 g de collagène dans un tube conique séparée.
    4. Centrifuger le collagène pour éliminer l'air à 4 ° C et 9343 g pendant 20-30 min.
    5. UV stériliser la hotte de culture cellulaire pendant 30 minutes, et à 14 pi de laminine à 4 ml du collagène. Cela se traduira par une concentration en laminine finale de 10 ug / ul. Remarque: La laminine fournit sintégrité STRUCTURELS, l'adhésion et la promotion de diverses réponses cellulaires.
    6. Allumer la lumière UV PCR pendant 20-30 min avant d'utiliser le capot pour la stérilisation.
    7. Placez le capuchon de verrouillage Luer, à joindre à une seringue de 20 ml, dans de l'éthanol pour une heure 2. Ensuite, laisser sécher et le placer dans la lumière UV.
    8. Gamma irradier le collagène 8,6 min pour atteindre 1200 cGy.
      Remarque: La durée dépendra de la désintégration de la source de césium. Ajuster le temps pour atteindre le même dosage.

6.Casting collagène sur BSA Caoutchouc

  1. Pour polymériser le collagène, utiliser un 8: 1: 1 (collagène: HEPES: MEM). La procédure suivante est basée sur une première 4 g de collagène acidifié (de l'étape 5.1.8).
    1. Faire une solution 0,2 N HEPES dans l'eau et ajuster le pH à 9 en ajoutant de petites quantités (1-5 pi) de 1-5 M d'hydroxyde de sodium (NaOH). En utilisant un pH-mètre étalonné, contrôler le pH de la solution après chaque addition. Conserver à 4 ° C ou keep sur la glace.
    2. Allumez la lumière UV de la culture de tissus hotte pendant 20-30 min pour stériliser le capot.
    3. forceps autoclave, spatule, et un scalpel pour la stérilisation.
    4. Mélanger 1,5 ml de 0,2 N HEPES (pH 9) et 1,5 ml de MEM 10x en utilisant la hotte de culture tissulaire. Assurez-vous de garder sur la glace et vortex pour 5 sec avant de l'utiliser. Conserver à 4 ° C ou garder sur la glace.
    5. Pour stériliser le capot PCR, allumer la lumière UV pendant 30 min.
    6. Placer une plaque à 12 puits et une seringue de 20 ml à -20 ° C pendant 10 min, ou jusqu'à ce que prêt à continuer. Remarque: Conservez tous les matériaux à froid jusqu'au moment de servir. L'augmentation de la température provoque la fibrillogénèse du collagène prématurée.
    7. Pulvériser tous les tubes et les plaques à puits qui vont être dans le capot avec 70% d'éthanol et les laisser sécher pour la stérilisation. Placer une seringue de 20 ml sur de la glace pour refroidir pour une utilisation ultérieure.
    8. Dans la hotte PCR, ouvrir les moules en acier inoxydable pour libérer le caoutchouc de BSA et de l'aide d'un scalpel, couper les canaux d'échappement de la BSA rmoule ubber.
    9. Sous le capot PCR, ouvrir les tubes de collagène stériles et ajouter 1 ml de la solution HEPES-MEM (faire en sorte que, avant d'extraire la solution HEPES-MEM, qu'il est bien mélangé et il n'y a pas de dépôts solides).
    10. Aide de la spatule stérile, bien mélanger la solution de collagène et de tampon.
    11. Fermer et vortex rapidement pour assurer un hydrogel bien mélangé.
    12. Transférer dans un froid seringue de 20 ml.
    13. D'une main, maintenez la BSA caoutchouc à l'intérieur du puits et, en utilisant l'autre, passer la moitié de la solution de collagène d'hydrogel sur le fond du puits.
    14. À l'aide des pinces stériles, veiller à ce que les extrémités d'amenée et d'évacuation de caoutchouc sont en contact avec les parois du puits.
    15. Verser la solution de collagène sur le dessus de la gomme jusqu'à ce que soit complètement recouverte.
    16. Assurez-vous que le caoutchouc BSA est suspendu dans le collagène et qu'il n'y a pas de bulles, en particulier à proximité des extrémités du caoutchouc.
    17. Placez le couvercle et envelopper autour du Parafilmcirconférence du puits.
    18. Mettez dans l'incubateur pendant 1 heure à 37 ° C. Garder la lumière UV PCR sur.
  2. Après la polymérisation du collagène, UV réticuler l'hydrogel via la procédure suivante.
    Remarque: La réticulation du collagène est réalisée en utilisant un appareil de réticulation UV, dans lequel la quantité d'énergie peut être contrôlée.
    1. Allumez l'agent de réticulation UV et d'utiliser le réglage de l'énergie pour irradier la chambre vide avec 630.000 pJ / cm 2.
    2. Retirez les gels de l'incubateur.
    3. Pulvériser sur les mains avec de l'éthanol, et, à l'intérieur de la chambre, enlever le couvercle le plus rapidement possible.
    4. Fermer la chambre et UV réticulation des hydrogels en sélectionnant le réglage de l'énergie et l'irradiation 630.000 pJ / cm 2.
    5. Après le cycle de réticulation, éteindre la lumière UV sur le capot PCR
    6. Pulvériser sur les mains avec de l'éthanol et d'ouvrir la chambre, placer rapidement le couvercle sur la plaque bien. Déplacer la plaque de puitsau capot PCR.
    7. Aide de la spatule stérile, desserrer légèrement et retirer le gel du puits. Retourner les gels sous le capot pour réticuler le fond de l'hydrogel. Répétez l'étape 6.2.3 et 6.2.4.

7. Enzyme de digestion de la BSA en caoutchouc

  1. Afin d'avoir un échafaudage de collagène creux, retirez BSA caoutchouc d'une manière qui ne porte pas atteinte aux dimensions incorporés dans l'hydrogel. La procédure est décrite ci-dessous.
    1. Allumer la lumière UV pendant 20 à 30 mn pour stériliser la hotte de culture tissulaire.
    2. Assurez 0,25% solution de trypsine à pH 7,8. Par exemple, pour 15 ml d'eau, ajouter 0,0376 g de trypsine dans un tube conique de 50 ml. Ajuster le pH à 7,8 en ajoutant de petites quantités (2-5 ul) de 1 M de NaCl. Placer la solution dans une seringue de 20 ml et coiffée d'un filtre à seringue de 0,20 um. Appuyez sur le piston pour expulser le liquide à travers le filtre et de recueillir la solution stérile dans un nouveau tube.
    3. Allumez le bain d'eau et de régler la température à 30° C.
    4. Après 30 minutes, éteindre la lumière UV. Pulvériser l'éthanol sur l'ensemble des tubes et des matériaux qui seront utilisés dans la hotte.
    5. Transférer l'hydrogel de collagène sous le capot et le lieu dans le tube conique séparée.
    6. Ajouter environ 3-5 ml (juste assez pour couvrir les gels) de solution de trypsine à 0,25% avec un pH de 7,8 à chaque tube.
    7. Sceller les tubes avec du parafilm et vortex légèrement pendant environ 1 min.
    8. Place dans le bain d'eau à 30 ° C pendant 15-24 h. Tandis que dans le bain d'eau, vortex légèrement les gels fréquemment jusqu'à ce que le caoutchouc a été digéré BSA ou retirée de l'hydrogel.
      Remarque: Afin de déterminer si le caoutchouc BSA a été supprimé, soit le caoutchouc est flottant dans la solution de trypsine ou il y a des pièces en panne. Il doit y avoir pas de zones sombres visuels au sein de l'hydrogel.
  2. Faire en sorte que tout le caoutchouc de BSA et de la trypsine ont été retirés des hydrogels, rinçage comme décrit ci-dessous.
    1. Allumez le hoo PCRd lumière UV pendant 20-30 min.
    2. Préparer la solution Mosconas. Combiner du chlorure de potassium (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), du glucose (9,4 mM) et (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) dans l'eau. Ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH ou une solution d'HCl 12 M. Placer la solution dans une seringue de 20 ml et en utilisant un filtre à seringue de 0,20 pm pour stériliser la solution.
    3. tout avec de l'éthanol pulvériser avant de les placer sur le capot et laisser l'éthanol à sécher.
    4. Ouvrir le tube et transférer 5-10 ml de solution stérile Mosconas à un nouveau 50 ml tube conique.
    5. Transférer l'hydrogel de collagène dans le tube conique contenant la solution d'enzyme. Assurez-vous que l'hydrogel est entièrement recouvert de la solution. Laisser le tube dans le shaker dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 30 min.
    6. Aspirer la solution Mosconas et répétez l'étape 7.2.5 deux fois.
    7. Conserver à 4 ° C.

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Résultats

Les résultats montrent que cette technique de biofabrication est efficace pour générer des échafaudages 3D qui peuvent imiter l'arrangement spatial vu dans les tissus in vivo. Les caractéristiques architecturales sont des paramètres essentiels pour l'application de l'ingénierie tissulaire, qui jouent un rôle crucial dans l'interaction in vivo de cellules et la fonctionnalité du tissu.

La consi...

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Discussion

Biofabrication est un domaine hautement multidisciplinaire dans laquelle les principes de la biologie et de l'ingénierie fusionnent pour générer des matériaux complexes qui imitent tissu natif. Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de développer des techniques qui utilisent les informations recueillies à partir de tissus in vivo et le traduire en un échafaudage in vitro. De cette manière, une plate-forme peut être modifiée génétiquement qui ressemble étroitement les propriétés architectura...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI) et le NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagène de type ICollagène extrait de la peau de veau
Acide chlororique (HCl)Sigma-Aldrich7647-01-0
Solution tampon de phosphate (comprimés PBS)MP BiomedicalU53781 comprimé par 100 ml donne 1x PBS
Albumium à partir de sérum bovin (BSA)Sigma-AldrichA9647
GlutaraldéhydeSigma -AldrichG5882Champs de
saindouxtoxiques 3090
Moules en acier inoxydablefraisés à l’aide d’une
Pneumatique central47791
Embout mélangeur pour seringue doubleMedmixML2.5-16-LLMMélangeur, DN2,5X16, 4:1 brun, med
Petit joint torique pour seringue doubleMedmixPPB-X05-04-02SMPiston B, 5 ml, 4:1, PE naturel
Double capuchon de seringue  ;MedmixVLX002-SMCapuchon, 4:1/10:1, PE brun, med
Grand joint torique pour seringue doubleMedmixPPA-X05-04-02SMPiston A, 5 ml, 4:1
Seringue doubleMedmixSDL X05-04-50MSeringue double, 5 ml, 4:1
Distributeur de seringues doublesMedmixDL05-0400M, 5 ml, 4:1, med, plain
Laminim3,6 mg/ml - extrait USC lab
Seringue de 20 ml Luer Lock TipBD302830
Luer Lock CapsFisherJGTCBLLX
HEPESSigma -AldrichH4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)Life Technologies1143-030
TrypsinLife Technologies27250-018
Réticulant UV  ;Spectroline UVXLE1000
Cloure de sodium (NaCl)FisherS271-10Pour préparer Mosconas
Chlorure de potassium (KCl)Sigma -AldrichP5405-250Pour préparer Mosconas
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)FisherBP328-500Pour préparer Mosconas
GlucoseSigma -AldrichG-8270Pour préparer Mosconas
Phosphate de sodium didasique (NaH2PO4)Sigma-AldrichS-7907Pour préparer Mosconas
Filtre stérile pour seringuesCorning431224
machine à microlution Kit d’aérographe

Références

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