Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
Histona-desacetilases 1 e 2 (HDAC1,2) localizam os sítios de replicação do ADN. No estudo anterior, utilizando-se um inibidor selectivo e um sistema genético knockdown, que mostrou novos funções para HDAC1,2 na replicação garfo progressão e manutenção nascente cromatina em células de mamífero. Além disso, usamos uma técnica BrdU-chip-Slot-ocidental que combina imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) DNA marcado com com slot blot e análise Ocidental para medir quantitativamente proteínas ou modificação da histona associadas com DNA nascente.
Activamente células em divisão foram tratados com HDAC1,2 inibidor selectivo ou transfectadas com ARNsi contra HDAC1 e HDAC2 e, em seguida, o ADN recém-sintetizado foi marcado com o análogo de timidina bromodesoxiuridina (BrdU). A marcação com BrdU foi realizada em um ponto de tempo quando não havia paragem do ciclo celular ou apoptose significativa devido à perda de funções HDAC1,2. Seguindo lAbeling de células com BrdU, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de marcas de acetilação de histonas ou da cromatina-remodeler foi realizada com anticorpos específicos. Entrada de ADN marcadas com BrdU e o imunoprecipitado (ou chiped) DNA foi então manchado para uma membrana utilizando a técnica de fenda blot e imobilizada utilizando UV. A quantidade de ADN nascente em cada slot foi depois avaliado quantitativamente usando análise de Western com um anticorpo anti-BrdU. O efeito da perda de funções HDAC1,2 sobre os níveis de histonas recentemente sintetizadas marcas de acetilação associado com ADN e cromatina remodeler foi então determinada através da normalização do sinal de BrdU-chip obtidos a partir das amostras tratadas para as amostras de controlo.
Introduction
Reparação de ADN defeituosos e / ou a replicação de DNA são uma das principais causas de instabilidade do genoma, o que pode provocar a morte celular. Uma única quebra de cadeia dupla unrepaired é suficiente para causar morte celular 1. Organização da cromatina é transitoriamente alterada durante a replicação e reparar 2,3, e falha em manter a informação epigenética durante esses processos irão resultar em uma ameaça à integridade do genoma. Perda de HDAC3 ou função HDAC1,2 impede a progressão da fase S, replicação e reparação do ADN, levando ao estresse genotóxico (dano ao DNA) e morte celular 4-9. É, por conseguinte, uma estratégia prático utilizar os inibidores de HDAC selectivos para interromper a replicação, reparação e cromatina em células cancerosas e causar danos no ADN, que por sua vez pode parar o crescimento e induzir a morte celular selectiva, em que crescem rapidamente células cancerosas.
Durante a replicação do DNA, cromatina é rapidamente desmontada e remontada em seguida, seguir a duplicação do DNA. Recém-synthesized histona H4 acetilada é a K5 e K12 (H4K5K12ac resíduos) e a seguir para a deposição de cromatina, são rapidamente desacetilado por histona desacetilases (HDACs) 10,11. A falha das células para manter a integridade da cromatina nascente pela histona desacetilação pode conduzir ao colapso da forquilha, que por sua vez pode resultar em danos no ADN e morte celular. Nós recentemente mostrou que a inibição seletiva de HDAC1,2 aumenta acetilação das histonas (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibe a atividade SMARCA5 cromatina remodeler na cromatina nascente, que se correlaciona com a redução da progressão da forquilha de replicação, maior colapso garfo e aumento da replicação do estresse induzido por danos no DNA 6 . Assim, o tratamento com inibidor de HDAC podem alterar a estrutura da cromatina nascente para provocar danos no ADN e morte muito rapidamente em células de cancro, uma vez que estas células ciclo rapidamente e muitas vezes passar através da fase-S. Por isso, é importante entender como HDACs funcionar para regular acetilação das histonas e bindi proteínang de manter replicação de ADN em células de mamífero.
Para medir quantitativamente a quantidade de acetilação das histonas e SMARCA5 remodeler cromatina associada à DNA durante a replicação do DNA nascente, eu inventei um ensaio ChIP modificada chamada a técnica de BrdU-chip-Slot-ocidental. Após imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de uma modificação da proteína ou histona desejado, a quantidade de ADN nascente (marcado utilizando análogo da timidina, BrdU) na amostra de chip pode ser detectada por meio de análise ocidental da marcadas com BrdU chip de ADN transferido para uma membrana utilizando um entalhe Aparelho Blot. Usando esta técnica, nós mostramos que H4K16ac (a marca envolvido em embalagem cromatina) eo membro da família ISWI SMARCA5 (dependente de actina regulador associada à matriz relacionada com o SNF SWI / da cromatina) remodeler cromatina estão associados com DNA nascente em células em fase S 6. Também descobrimos que a marca H4K16ac nascente é desacetilada por HDAC1,2 durante a replicação do DNA 6. Inibe H4K16acatividade remodeler cromatina do membro da família ISWI SMARCA5 12. Assim, usando a técnica de-BrdU-CHIP-Slot Ocidental, podemos conectar as funções para HDAC1,2 na regulação da remodelação da cromatina durante a replicação do DNA. Assim, a técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot é uma abordagem poderosa para medir quantitativamente a associação e dissociação dinâmica de proteínas ou suas modificações pós-traducionais que são obrigados a DNA nascente.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito neste manuscrito é um método relativamente rápido para demonstrar a presença das proteínas ou as suas formas modificadas pós-tradução de DNA recentemente replicado ou nascente. Além disso, esta técnica permite um para medir a cinética da associação, dissociação de uma proteína ou a sua forma modificada com o ADN nascente. Esta técnica é complementar da tecnologia elegante iPOND 13. Na tecnologia iPOND, ADN sintetizado de novo é marcado com acetato de desoxiuridina (EdU)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho neste manuscrito foi apoiada por fundos do Departamento de Radioterapia Oncologia e Huntsman Cancer Institute e do Instituto Nacional de concessão de Saúde (R01-CA188520) para SB. Agradeço Danielle Johnson e Steven Bennett no meu laboratório para demonstrar o protocolo e explicando os seus benefícios. Sou grato ao Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) para comentários críticos sobre o manuscrito.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
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