SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에
Summary
이 작업은 수용액 중의 단백질의 생체 시츄 비행 시간 형 2 차 이온 질량 분석기 분석을위한 마이크로 액체 취급 및 샘플 도입을위한 프로토콜을 나타낸다.
Abstract
이 작업은 액체 진공 인터페이스 (SALVI) 및 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석법으로 분석 시스템을 사용하여 수용액의 단백질의 생체 시츄 특성화 보여준다. 피브로넥틴 단백질 막을 SALVI 감지 영역을 형성하는 상기 실리콘 질화물 (SIN) 막 상에 고정화 하였다. 으로 ToF-SIMS 분석에서, 분석의 세 개의 모드는 높은 공간 분해능 질량 분석법, 2 차원 영상 및 깊이 프로파일 링을 포함하여 수행 하였다. 질량 스펙트럼을 양성 및 음성 모드를 모두 취득 하였다. 탈 이온수는 기준 샘플로서 분석 하였다. 우리의 결과는 물에 피브로넥틴 영화는 혼자 물에 비해 더 독특하고 강한 물 클러스터 피크를 가지고 있음을 보여준다. 아미노산 단편의 특징적인 피크는 단백질 수화으로 ToF-SIMS 스펙트럼에서 관찰 가능하다. 이러한 결과는 표면에 단백질 분자의 흡착 dynamica을 연구 할 수있는 예시에서야 처음으로 액체 환경에서 SALVI 및으로 ToF-SIMS를 사용하여.
Introduction
수화 구조, 형태 1, 2 단백질의 생물학적 활성을 3 중요하다. 그들을 둘러싼 물 분자가없는 단백질은 실행 가능한 생물학적 활성이없는 것입니다. 특히, 물 분자가 표면 단백질의 내부 구조와 상호 작용 단백질의 상이한 수화 상태는 별개 이러한 상호 작용을 만든다. (4) 고체 표면과 단백질의 상호 작용은 나노, 바이오 물질 및 조직 공학 프로세스의 의미와 기본적인 현상이다. 연구는 긴 단백질이 표면에 발생으로 구조적인 변화가 발생할 수 있음을 지적했다. 으로 ToF-SIMS는 단백질 – 고체 계면을 연구 할 수있는 잠재력을 가지고 기술로서 구상되었다. 5-7 이는 잠재적으로 그 구조의기구의 기본적인 이해를 제공 고체 표면에 단백질의 수화를 이해하는 것이 중요 형태 및 생물학적등 활동.
그러나, 주 표면 분석 기술은 주로 진공 기반 휘발성 액체 연구 직접 애플리케이션 인해 진공 분위기 하에서 휘발성 액체의 신속한 증발하기 어렵다. 우리는 액체 표면과 액체 – 고체 상호 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석기를 사용하여 직접 관찰을 가능하게하는 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에서 분석 호환 미세 인터페이스 시스템에 진공을 개발 하였다. 8- 2) 표면 장력이 개구 내에 상기 액체를 보유하기 위해 사용되는 1) 검출 창 액면 직접 촬상 있도록 직경 2-3 μm 인 개구이며 3) SALVI는 11 독특한 양상은 다음과 같다 여러 분석 플랫폼 사이의 휴대용. (11, 12)
SALVI은 검출 영역 및 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 마이크로으로서 실리콘 질화막 (SiN) 막으로 구성된다. 그것은 fabr입니다클린 룸에서 icated하고, 제조 및 핵심 설계 요소는 이전의 논문 및 특허에 자세히 설명되어있다. 8-12 분석 도구 등으로 ToF-SIMS의 응용 프로그램의 일부 수용액 복잡한 액체 혼합물의 다양한 사용하여 시연 하였다 이는 나노 입자가 포함되어 있습니다. 13-17 구체적으로는, SALVI 액으로 ToF-SIMS는 현장 응축 단계에서 새로운 기회를 열어, 라이브 생물학적 시스템 (즉, 바이오 필름), 단일 세포 및 고체 전해질 인터페이스의 액체 – 고체 계면의 프로빙 동적 수 있습니다 으로 ToF-SIMS를 사용하여 액체를 포함하는 연구. 그러나, 현재의 디자인은 아직 기체 – 액체의 상호 작용을 허용하지 않습니다. 이것은 미래의 발전을위한 방향이다. SALVI 처음 본 연구에서 수화 된 막 단백질을 연구하기 위해 사용되었다.
피브로넥틴은 거의 동일한 두 개의 이황화 결합에 의해 연결된 한 쌍의 단량체 (18)로 이루어진, 일반적으로 사용되는 단백질 이량 인 I세포에 결합하는 능력에 대해 잘 알려지. 그것은 모델 시스템으로 선택되었다 (19, 20)을 수화 단백질 막 동적 SALVI 액으로 ToF-SIMS를 사용하는 방식 프로브 될 수 있음을 설명하기 위해. 단백질 용액은 마이크로 채널에 도입 하였다. 12 시간 동안 배양 한 후에, 수화 된 막 단백질의 SiN 막의 배면 측에 형성되어있다. 탈 이온수 (DI) 물은 단백질 도입 한 후의 채널을 씻어 하였다. 정보는 동적으로 ToF-SIMS를 사용하는 마이크로 채널 SALVI 수화 피브로넥틴 단백질 분자로부터 수집 하였다. DI 물은 수화 피브로넥틴 박막에서 얻은 결과와 비교 대조군으로 연구 하였다. 뚜렷한 차이점은 수화 단백질 막 및 DI 물 사이에서 관찰되었다. 이 작업은, 액체 환경에서 표면 단백질 흡착은 신규 SALVI 액상으로 ToF-SIMS 방식을 사용하여 조사 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 비디오 프로토콜은 관심이있는 사람들을위한 기술지도를 제공하기위한 것입니다으로 ToF-SIMS와 SALVI의 다양한 애플리케이션을위한 새로운 분석 도구를 활용하고으로 ToF-SIMS 데이터 수집 및 분석뿐만 아니라 액체 처리에 불필요한 실수를 줄일 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI 등으로 ToF-SIMS 및 주사 전자 현미경 (SEM)과 같은 진공 기반기구에 의해 동적 액면과 액체 – 고체 계면 분석을 허용 미세 인터페이스이다. 작은 구멍의 사용은 직접 진공 액체에 노출하기 때문에, SALVI은 수정없이 많은 미세하게 초점을 맞춘 분광기 및 이미징 기술에 적합한 22 이동성과 미세 유체의 다양성이 진정한 멀티 모달 이미징 플랫폼입니다. 별개의 기능 및 기존의 기술에 비해 SA…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
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