In Situ Caratterizzazione di idrate proteine in acqua da Salvi e TOF-SIMS
Summary
Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.
Abstract
Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l'analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l'area di rilevamento SALVI. Durante l'analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell'ambiente liquido per la prima volta.
Introduction
L'idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine senza molecole d'acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d'acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine rendono tali interazioni distinte. 4 L'interazione delle proteine con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti conformazionali possono verificarsi come proteina incontra una superficie. ToF-SIMS è stato concepito come la tecnica che ha il potenziale per studiare all'interfaccia proteina-solido. 5-7 È importante comprendere l'idratazione di proteine su superfici solide, che fornisce potenzialmente una comprensione fondamentale del meccanismo della loro struttura, conformazione e biological'attività al.
Tuttavia, le tecniche analitiche superficie maggiore sono per lo più sotto vuoto-based e applicazioni dirette per Studi liquidi volatili sono difficili a causa della rapida evaporazione del liquido volatile in ambiente sottovuoto. Abbiamo sviluppato un vuoto un'interfaccia microfluidica compatibile, sistema per l'analisi presso l'interfaccia Vacuum Liquid (SALVI), per consentire osservazioni dirette di superfici liquide e interazioni liquido-solido che utilizzano tempo di volo di ioni secondari spettrometria di massa (TOF-SIMS). 8- 11 Gli aspetti unici sono i seguenti: 1) la finestra di rilevamento è un'apertura di 2-3 micron di diametro che permette l'imaging diretto della superficie del liquido, 2) tensione superficiale è utilizzato per contenere il liquido all'interno del diaframma, e 3) Salvi è portatile tra più piattaforme analitiche. 11,12
Salvi è composto da una membrana di nitruro di silicio (SiN) come area di rilevamento e un microcanale in polidimetilsilossano (PDMS). E 'fabricated nella stanza pulita, ei fattori di fabbricazione e di progettazione chiave sono stati dettagliatamente nei precedenti documenti e brevetti. 8-12 Le applicazioni di ToF-SIMS come strumento analitico sono state dimostrate utilizzando una varietà di soluzioni acquose e le miscele di liquidi complessi, alcuni dei che conteneva le nanoparticelle. 13-17 in particolare, SALVI liquido TOF-SIMS consente dinamica sondare l'interfaccia liquido-solido dei sistemi live biologici (ad esempio, biofilm), celle singole, e l'interfaccia solido-elettrolitico, aprendo nuove opportunità per in situ condensato fase studi, tra cui liquidi con l'ausilio TOF-SIMS. Tuttavia, il design attuale non consente ancora interazioni gas-liquido. Questa è una direzione per lo sviluppo futuro. SALVI è stato utilizzato per studiare il film proteina idrata in questo lavoro per la prima volta.
Fibronectina è un dimero proteine comunemente usato, costituito da due monomeri quasi identici collegati da una coppia di ponti disolfuro, 18 che is ben noto per la sua capacità di legare le cellule. 19,20 E 'stato scelto come sistema modello per illustrare che il film proteina idratata potrebbe essere sondato in modo dinamico con il liquido SALVI ToF-SIMS approccio. La soluzione proteica è stata introdotta nel microcanali. Dopo incubazione per 12 ore, un film proteina idratata formata sul lato posteriore della membrana SiN. Deionizzata (DI) l'acqua è stata utilizzata per risciacquare il canale dopo l'introduzione di proteine. Le informazioni sono state raccolte da idrati molecole di proteine fibronectina nel microcanali SALVI usando dinamica TOF-SIMS. DI acqua è stato studiato anche come controllo da confrontare con i risultati ottenuti da idratato film sottile fibronectina. sono state osservate differenze distinte tra il film proteina idratata e acqua deionizzata. Questo lavoro dimostra che l'assorbimento di proteine sulla superficie in ambiente liquido può essere studiato con il romanzo Salvi e liquido approccio ToF-SIMS. Il protocollo video è destinato a fornire una guida tecnica per le persone che sono interessatead utilizzare questo nuovo strumento di analisi per le diverse applicazioni di SALVI con ToF-SIMS e ridurre gli errori inutili in gestione dei liquidi, nonché l'acquisizione di dati ToF-SIMS e l'analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
SALVI è un'interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l'utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging mu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution: > 10,000 m/Δm for mass resolution; > 4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1000 mL |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1000 µL |
| Centrifuge Tube | Corning | 430791 | 15 mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/mL |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
References
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding?. Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M. Opinion – Do we underestimate the importance of water in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).
- Zhang, L., et al. Mapping hydration dynamics around a protein surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).
- Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films. Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).
- Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).
- Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling. Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- Yang, L., Yu, X. -. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS. LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).
- Yu, X. -. Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , (2013).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , (2014).
- Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -. Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces. Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Pankov, R., Yamada, K. M. Fibronectin at a glance. J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).
- Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule. Cell. 26 (2), 259-267 (1981).
- Engvall, E., Ruoslahti, E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).
- Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).
- Yu, X. -. Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -. Y. Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments. Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).
- Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Gilmore, I. S. SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook. J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819 (2013).
- Muramoto, S., et al. ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns. J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).
- Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA. Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).
- Gustavsson, J., et al. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications. J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).
- Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells. Regen Biomater. , 17-25 (2014).
