En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders
Summary
In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O 2 .- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.
Abstract
Endotheel afgeleide stikstofoxide (NO) geproduceerd met endotheliale NO-synthase (eNOS) is een van de belangrijkste vasoprotective moleculen in cardiovasculaire fysiologie. Disfunctioneel eNOS zoals ontkoppeling van eNOS leidt tot afname NO biobeschikbaarheid en toename van superoxide anion (O 2 .-) productie, en op zijn beurt stimuleert hart- en vaatziekten. Daarom geschikte meting van NO en O 2 .- niveaus in de endotheelcellen cruciaal voor onderzoek op hart- en vaatziekten en complicaties. Vanwege de uiterst labiele aard van NO en O 2 .-, is moeilijk te meten NO en O 2 .- direct in een bloedvat. Talrijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor het meten en NO O 2 .- productie. Het is echter ook ongevoelig of niet-specifieke of technisch veeleisend en vereist speciale apparatuur. Hier beschrijven we een aanpassingvan de fluorescentie kleurstof werkwijze voor het gezicht en gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire NO en O 2 .- via de cel permeabele diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE), respectievelijk in intacte aorta van een obesitas muismodel opgewekt door hoog-vet dieet geeft. Wij konden aantonen verminderde intracellulaire NO en verbeterde O 2 .- niveaus in de vers geïsoleerde intacte aorta van obesitas muis in vergelijking met de controle lean muis. We tonen aan dat deze werkwijze een gemakkelijke techniek voor directe detectie en visualisatie van NO en O 2 .- in de intacte bloedvaten en kan wijd voor onderzoek endotheel (dys) functie onder (fysio) pathologie.
Introduction
De vasculaire endotheelcellen houden vasculaire functionele en structurele integriteit door het vrijgeven van vasoactieve factoren 1. Onder deze factoren, endotheel- afgeleide stikstofoxide (NO) geproduceerd uit L-arginine via endotheliale NO-synthase (eNOS) is de belangrijkste en gekenmerkt factor bij cardiovasculaire fysiologie 2. NO veroorzaakt relaxatie van glad spierweefsel en remt de celproliferatie remt plaatjesaggregatie en ontstekingscellen adhesie en infiltratie in de subendothele ruimte derhalve bescherming tegen vaatziekten ontwikkeling 3. Onder vele fysiologische en pathologische aandoeningen, zoals vergrijzing, hypertensie, diabetes, hyperlipidemie, etc., endotheeldisfunctie gekenmerkt door verminderde NO biobeschikbaarheid en verhoogde O 2 .- productie aanwezig en bevordert de pathogenese van atherosclerose 2. Studies van de afgelopen jaren laten zien dat ontkoppeling van eNOS is eenbelangrijk mechanisme voor de endotheliale dysfunctie, waarbij het enzym eNOS genereert O 2 .- plaats van NO, onder de verschillende bovengenoemde voorwaarden 1,4. Daarom analyse van endotheelfunctie name endotheliale NO productie en O 2 .- generatie cruciaal voor experimenteel onderzoek op hart- en vaatziekten en complicaties.
Er zijn talrijke methodologische benaderingen die zijn ontwikkeld voor het analyseren en meten NO productie in biologische monsters. Door de zeer labiele aard van NO die gemakkelijk wordt geoxideerd tot NO 2 – en NO 3 – met een halfwaardetijd van 3 tot 6 seconden is moeilijk direct te meten NO. Derhalve bepaling van NO 2 – / NO 3 – in de vloeistofmonsters werd gebruikt als een index van NO werd vrijgemaakt uit cellen of weefsels 5. Hoewel de procedure is relatief eenvoudig, de werkwijze is echter eaSily beïnvloed door de hoge achtergrond van de stabiele NO 2 – / NO 3 – in de oplossing. Omdat NO stimuleert oplosbaar guanylaatcyclase aan cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP) 6 te produceren, heeft het cellulaire cGMP niveau ook is vastgesteld dat NO vrijkomen 7 schatten. Ook dit is een indirecte schatting en is derhalve niet specifiek, aangezien sommige endotheel-afgeleide factoren zoals C-type natriuretisch peptide (CNP) ook zou kunnen vergroten cGMP via activering van guanylaatcyclase deeltjesvormig 8. NO wordt geproduceerd uit L-arginine met vorming van L-citrulline als bijproduct 9, meting van L-citrulline productie wordt daarom ook gebruikt als een indirecte methode om NO productie schatten. De belangrijkste nadelen van deze methode zijn dat het radioactief is en het niet bioactieve NO te meten, omdat NEE Vrijgegeven kon snel worden geïnactiveerd door O 2 .-; Bovendien kan L-citrulline worden teruggevoerd naar L-arginine 10. Andere chemische werkwijzen zoals chemiluminescentie detectie 11, elektronspinresonantie 12 of elektrochemische porphyrinic NO sensor 13 worden gebruikt door verschillende onderzoekers. Deze methoden zijn meestal niet gemakkelijk in operationele, het opsporen van procedures en vereisen speciale apparatuur. Het is ook te vermelden dat veel studies orgaanbad experimenten toe te passen met geïsoleerde bloedvaten, met of zonder het endotheel om endotheelfunctie beoordelen en indirect meet-endotheel afgeleide NO gemedieerde vasculaire relaxaties. Deze werkwijze, hoewel meestal vlakbij fysiologische situatie, maar strikt wil zeggen niet geen functie meten, in plaats beoordeelt endotheel gemedieerde vasomotorische respons in het algemeen dat netto effect van eNOS functie tijdens de productie van andere endothelium afgeleide relaxerende factoren en endotheelafhankelijke verdragsluitende factoren, productie van O 2 .-, alsmede de respons van gladde spiercellendeze factoren. Een specifieke analyse van eNOS functie of NO productie is meestal nodig 3.
Vele onderzoeksgroepen waaronder ons hebben de afgelopen jaren gebruikt de fluorescentie kleurstof methode om intracellulaire productie van NO 14-19 detecteren. In deze werkwijze wordt de cel permeabele fluorescentie-indicator diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) werd gebruikt om vrije en NO NOS functie meten in levende cellen en weefsels in vitro of ex vivo. Het principe is dat in de levende cellen, DAF-2DA wordt gedeacetyleerd door intracellulaire esterase aan niet-fluorescerende 4,5- diaminofluorescein (DAF-2), die vervolgens werd omgezet in 2 DAF-triazool (DAF-2T) fluorescerende door reactie met NO . De fluorescentie van DAF-2T kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop of fluorescentie confocale microscoop 14. De intracellulaire fluorescentie-intensiteit dekt dus de intracellulaire NO productie in de cellen of het endotheel in een intacte bloed vessel. Gecombineerd met een specifieke fluorescentie kleurstof zoals dihydroethidium (DHE), kan men tegelijkertijd beoordelen intracellulaire NO en O 2 .- opwekking in de cellen of in bloedvaten 14. Evenzo DHE is een cel-permeabele stof die wordt geoxideerd door O 2 .- in de cellen, en het product vervolgens oxidatieve intercalaten met nucleïnezuren om een helderrode kleur detecteerbaar kwantitatief fluorescentiemicroscoop of fluorescentie confocale microscoop uitstoten. DHE is een zeer specifieke kleurstof voor detectie van O 2 .- uit biologische monsters, zoals gedetecteerd wezen superoxide radicalen, goed vastgehouden door cellen, en kunnen zelfs milde fixatie 20 tolereren. Een van de voordelen van deze fluorescentie kleurstof methode is dat het detecteert en visualiseert NO en / of O 2 .- en face direct aan de intacte endotheliale laag van een levend bloedvat.
In deze krant,beschrijven we deze fluorescentie kleurstof methode om NO te detecteren en O 2 .- die we hebben aangepast voor en gezichtsherkenning van NO en O 2 .- in intacte aorta's van een obesitas muismodel geïnduceerd door vetrijk dieet (HFD) voeding. We laten zien dat deze methode met succes en betrouwbaar kunnen meten NO en O 2 .- niveaus en eNOS (dys) functie te evalueren in de endotheliale laag van vers geïsoleerde intact muis aorta's in obesitas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detectie van NO of O 2 .- met fluorescerende kleurstoffen werd veelvuldig bij vele studies in gekweekte endotheliale cellen en in weefsels cryosecties 23. Hier uitgebreid we deze methode om intacte levende bloedvaten, dat wil zeggen, en gezichtsherkenning van NO en O 2 .- niveaus in de endotheliale laag met DAF-2DA en DHE, respectievelijk, die effectief is, relatief eenvoudig en intuïtief. In vergelijking met de werkwijze in vasculaire vriescoupes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
