Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Summary

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O ₂ ^.- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Abstract

óxido nítrico derivado do endotélio (NO) produzido a partir de NO endotelial (eNOS-sintetase) é um dos mais importantes moléculas vasoprotetores na fisiologia cardiovascular. Disfuncional eNOS tais como desacoplamento da eNOS conduz à diminuição da biodisponibilidade do NO e aumento no anião superóxido _(O2 ^.-) produção, e por sua vez promove a doenças cardiovasculares. Portanto, a medida apropriada de NO e O ₂ ^.- níveis nas células endoteliais são fundamentais para a pesquisa sobre doenças cardiovasculares e complicações. Devido à natureza extremamente lábil de NO e _O2 ^.-, é difícil de medir NO e _O2 ^.- directamente num vaso sanguíneo. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir NO e O ₂ ^.- produção. É, no entanto, seja insensível, ou não específica, ou tecnicamente exigente e requer equipamento especial. Aqui nós descrevemos uma adaptaçãoo método de fluorescência de corante para a detecção simultânea PT rosto e visualização de intracelular NO e _O2 ^.- usando a célula permeável diaminofluorescein 2-diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), respectivamente, em aortas intactas de um modelo de rato de obesidade induzida pela alimentação rica em gordura com a dieta. Pudemos demonstrar diminuição intracelular NO e O reforçada ₂ ^.- níveis nas aortas intactas recentemente isolados de rato obesidade, em comparação com o mouse magra controle. Nós demonstramos que este método é uma técnica fácil para detecção direta e visualização de NO e O ₂ ^.- nos vasos sanguíneos intactos e podem ser amplamente aplicada para investigação da função endotelial (dis) em (fisio) condições patológicas.

Introduction

As células endoteliais vasculares manter a integridade funcional e estrutural vascular pela liberação de fatores vasoativos ^1. Entre estes factores, o óxido nítrico derivado do endotélio (NO) produzido a partir de L-arginina através de NO endotelial (eNOS-sintase) é o factor mais importante e mais bem caracterizado na fisiologia cardiovascular ^2. NO provoca relaxamento do músculo liso e inibe a proliferação celular, inibe a agregação plaquetária e aderência de células inflamatórias e infiltração no espaço subendotelial, por conseguinte, proteger contra o desenvolvimento de doenças vasculares ^3. Sob muitas condições fisiológicas e patológicas, incluindo envelhecimento, hipertensão, diabetes, hiperlipidemia, etc, disfunção endotelial caracterizada pela diminuição da biodisponibilidade do NO e aumentou a produção _{de O2} ^.- está presente e promove a patogénese da aterosclerose ^2. Estudos realizados em anos recentes demonstram que o desacoplamento da eNOS é ummecanismo importante para a disfunção endotelial, em que a enzima eNOS gera _O2 ^.-, em vez de NO, de acordo com as várias condições acima mencionadas ^1,4. Portanto, a análise da função endotelial, em particular, a produção de NO endotelial e O ₂ ^.- geração é crucial para a pesquisa experimental sobre as doenças cardiovasculares e as complicações.

Há várias abordagens metodológicas que têm sido desenvolvidos para analisar e medir a produção de NO em amostras biológicas. Devido à natureza extremamente lábil de NO que é facilmente oxidado a NO ₂ ^– e NO ₃ ^– com uma semi-vida de 3 a 6 segundos, é difícil de medir directamente NO. Portanto, a determinação de NO ₂ ^– / _NO3 ^– nas amostras de fluido foi utilizada como um índice de NO libertado a partir de células ou tecidos ^5. Embora o procedimento é relativamente fácil, o método é, no entanto, eAsily afectados pela alta fundo do NO estável ₂ ^– / _NO3 ^– contido na solução. Porque NO estimula a guanilato ciclase solúvel para produzir monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) ^6, o nível de cGMP celular também foi determinada para estimar a libertação de NO ^7. Mais uma vez, esta é uma estimativa indirecta e não pode ser específico, uma vez que alguns factores derivados do endotélio tais como a-peptídeo natriurético tipo C (CNP) também pode aumentar os níveis de cGMP por meio de activação de ciclase de guanilato em partículas ^8. O NO é produzido a partir de L-arginina com a geração de L-citrulina como um sub-produto ^9, a medição da produção de L-citrulina é, por conseguinte, também utilizada como um método indirecto para estimar a produção de NO. As principais desvantagens deste método são que ele é radioativo e não medir os níveis de NO bioativos, pois NÃO Autorização poderia ser rapidamente inactivado pelo O ₂ ^.-; Além disso, a L-citrulina pode ser reciclado para L-arginina ^10. Outros métodos químicos, tais como detecção de quimiluminescência ^11, elétron de spin ressonância ^12, ou porfirínico eletroquímico NO sensor de ¹³ são utilizados por vários investigadores. Estes métodos geralmente não são fáceis em funcionamento, procedimentos de detecção e requer equipamento especial. É também de referir que muitos estudos aplicar experiências banho de órgãos com os vasos sanguíneos isolados com ou sem o endotélio para avaliar a função endotelial e indiretamente Medida mediada relaxamentos vasculares derivados do endotélio. No entanto, este método, embora seja principalmente perto de situação fisiológica, mas estritamente a dizer, não mede NO função, em vez avalia respostas vasomotores mediada pelo endotélio em geral que refletem efeitos líquidos da função eNOS, a produção de outra relaxante derivado do endotélio factores e factores contratantes derivado do endotélio, a produção de _O2 ^.-, e também as respostas das células musculares lisasa estes factores. A análise específica da função eNOS ou nenhuma produção é geralmente necessária ^3.

Muitos grupos de investigação, incluindo o nosso, nos últimos anos usaram o método do corante de fluorescência para detectar a produção intracelular de NO ^14-19. Neste método, a célula indicadora fluorescente permeável diaminofluorescein 2-diacetato (DAF-2DA) foi usada para medir a função NÃO livre e NOS em células e tecidos in vitro ou ex vivo vivo. O princípio é que nas células vivas, DAF-2DA é desacetilada por esterase intracelular para não-fluorescente de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), que foi depois convertida a fluorescente DAF 2-triazole (DAF-2T) fazendo reagir com NO . A fluorescência a partir de DAF-2T podem ser observados sob um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal de fluorescência ^14. Por conseguinte, a intensidade de fluorescência intracelular reflecte a produção de NO intracelular nas células do endotélio ou de um vesse no sangue intactoeu. Combinado com um corante fluorescente específico, tal como dihydroethidium (DHE), pode-se avaliar simultaneamente intracelular NO e _O2 ^.- geração nas células ou nos vasos sanguíneos ^14. Da mesma forma, a DHE é também um composto de células-permeável que é oxidado por O ₂ ^.- interior das células, e, em seguida, o produto oxidativo intercala com ácidos nucleicos para emitir uma cor vermelho brilhante detectável quantitativamente por microscopia fluorescente ou de fluorescência microscópio confocal. A DHE é um corante muito específico para a detecção de O ₂ ^.- a partir de amostras biológicas, que detecta essencialmente radicais superóxido, é mantida assim por células, e pode mesmo tolerar fixação suave ^20. Uma das vantagens deste método de fluorescência do corante é que ele detecta e visualiza NO e / ou _de O ₂ ^.- en face directamente sobre a camada endotelial intacta de um vaso sanguíneo de estar.

Nesse papel,descrevemos este método de fluorescência de corantes para detectar NO e O ₂ ^.- que temos adaptado para en detecção de face de NO e O ₂ ^.- em aortas intactas de um modelo de rato obesidade induzida por alta gordura com a dieta (HFD) alimentação. Nós demonstramos que este método poderia com sucesso e de forma confiável medir NO e O ₂ ^.- níveis e avaliar a função eNOS (dis) na camada endotelial de aortas de rato intactas recém-isoladas em obesidade.

Protocol

animal de trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Veterinário de Fribourg, Suíça. O protocolo segue as orientações sobre cuidados com os animais e experimentação em nossa instituição. 1. Preparação de um Set-up para a incubação de Isolated Artérias Construção de um sistema de banho de órgãos que pode ser aquecida a 37 ° C e arejada com 95% de O2 e 5% de CO 2 a partir de um tanque de gás de carbono. Preparar de forma muito…

Representative Results

A obesidade é um importante fator de risco de doença cardíaca isquêmica coronariana e está associada à diminuição endoteliais biodisponibilidade, uma característica da doença vascular aterosclerótica 21. eNOS desacoplamento foi demonstrado ser um importante mecanismo de disfunção endotelial sob várias condições fisiológicas e patológicas, incluindo envelhecimento 22, aterosclerose, obesidade e 14. Portanto, aqui vamos comparar os ratos m…

Discussion

Detecção de NO ou O ₂ ^.- com corantes fluorescentes era frequentemente usado em muitos estudos em células endoteliais cultivadas e também em criosecções tecido ^23. Aqui nós estendemos este método para os vasos sanguíneos de vida intacta, ou seja, en detecção de face de NO e O ₂ ^.- níveis na camada endotelial com DAF-2DA e DHE, respectivamente, o que é eficaz, relativamente simples e intuitiva. Em comparação com o método no …

Materials

Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA)	Calbiochem	251505	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D 1306	dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C
Mounting medium	Vector labor. (reactolab)	H-1000
L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl)	Sigma-aldrich	A5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 610M
Microscope	Nikon	SMZ800
Confocal microscope	Leica	DM6000
Image processing software	National Institute of Health(NIH)	Image J
Surgical scissors	S&T AG	SDC-11
Microsurgical scissors	F.S.T	15000-01
Forceps	S&T AG	JF-5
26G×1/2ʺ syringe	Becton Dickinson	305501
Coverslip round diam15mm	vwr	631-1579
Tips 1 mL	vwr	RFL-1200c
Tips 200 uL	vwr	613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Acetylcholine chloride	Sigma-aldrich	A-6625