Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"centromères" ont été classiquement définis comme régions de recombinaison méiotique supprimée en génétique et plus tard reconnu comme la constriction primaire des chromosomes mitotiques, qui joue un rôle essentiel dans la ségrégation des chromosomes lors de la mitose précise. "cinétochores" ont été décrits comme des structures à couches multiples qui se lient aux microtubules à la surface de centromères, telle qu'elle est révélée par microscopie électronique; "cinétochores" ont ensuite été définis comme étant le complexe macromoléculaire qui se localise au niveau du centromère des chromosomes mitotiques. En dépit d'une divergence considérable de séquences d'ADN centromériques parmi les vertébrés, la structure et la composition kinétochore sont hautement conservées. Une interaction dynamique entre microtubules du fuseau et kinétochore est nécessaire pour la ségrégation fidèle des chromosomes lors de la mitose, et les défauts de centromère-kinétochore fonction conduisent à une aneuploïdie et ainsi le cancer.
Centromère dans la plupart des eucaryotesa pas de séquence d'ADN définie, mais est composé de grands réseaux (0,3-5 Mo) d'ADN alphoïde répétitif constitué d'ADN α-satellite de 171 pb. Sauf dans la levure bourgeonnante, l' identité de centromère est obtenue non pas par la séquence d'ADN , mais par la présence d'un nucléosome spécial qui contient le variant de l' histone H3 CENH3 (centromère protéine A [CENP-A] chez l' homme). 5 nucléosomes CENP-A localisent au plaque intérieure de kinétochores mammifères 7 et se lient à l'ADN α-satellite de 171 pb. centromères actifs exigent CENP contenant A-nucléosomes pour diriger le recrutement d'un réseau constitutif centromère-associé (CCAN) et les protéines kinétochoriens, qui régulent ainsi l'attachement des chromosomes au fuseau mitotique et la progression du cycle suivant à travers le point de contrôle de la broche.
À la lumière de la preuve ci – dessus, CENP-A a été proposé d'être la marque épigénétique du centromère 8; toutefois, le processus par lequel CENP-A est incorporé into ADN centromérique et les facteurs responsables de cette incorporation ont pas encore été bien caractérisée. Un domaine de centromère ciblage courte (DTAC) réside dans le histone fold région CENP-A, et le remplacement de la région correspondante de H3 avec le CATD est suffisante pour H3 directe du centromère. 9 Plusieurs études ont suggéré des rôles fonctionnels pour post-traductionnelle modification (PTM) de CENP-A 12-16; Cependant, les mécanismes moléculaires de ces PTM de CENP-A dans le recrutement à centromères n'a pas encore été élucidé. Nous avons déjà indiqué que l' activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour CENP-A K124 ubiquitylation et la localisation de CENP-A à centromères 17.
La découverte et la caractérisation des protéines kinétochoriens ont conduit à de nouvelles connaissances en ce qui concerne la ségrégation des chromosomes. 18 Plus de 100 éléments kinétochoriens ont été identifiées dans les cellules de vertébrés par diverses approches. Une sous 19,20méthodes permanentes de la façon dont cinétochores assemblent et la fonction vient également de la caractérisation des fonctions cellulaires de chaque réseau centromère-kinétochore protéines et protéine-protéine dans les cellules. 19 visualisation directe et d' imagerie de pointe en microscopie de fluorescence fournissent remarquable résolution de composants centromère-kinétochore et permettent l'observation directe des composants moléculaires spécifiques des centromères et kinétochores. En outre, les méthodes d'immunofluorescence indirecte (IIF) coloration en utilisant des anticorps spécifiques sont cruciaux pour ces observations. Cependant, en dépit de nombreux rapports sur les protocoles IIF, peu abordés dans les problèmes de détail de protéines centromériques-kinétochore spécifiques. 1-4 Ainsi, le développement et les méthodes de déclaration de IIF coloration et un dosage quantitatif IIF pour analyser spécifiquement chaque protéine centromère-kinétochore est extrêmement important. Dans IIF coloration, il faut procéder avec le protocole de coloration pour éviter la perte de la protéine d'intérêt oule reste de la cellule. Cependant, la fixation détruit les sites antigéniques de temps en temps, et des combinaisons anticorps-antigène fonctionne mal avec un fixatif, mais très bien avec les autres, 21 et le choix de fixatif dépend en grande partie de la protéine (s) d'intérêt. Par conséquent, les différentes méthodes de fixateur sont cruciales dans IIF coloration des protéines centromériques-kinétochore.
Méthodes ici optimisées immunofluorescence indirecte (IIF), la coloration et un essai pour résoudre la localisation des protéines centromère kinétochore endogènes, y compris CENP-A et les protéines CENP-A exogènes étiquetée FLAG, et la quantification de ces protéines dans des cellules humaines ont été développées. Ces procédés peuvent être appliqués à l'analyse des protéines centromériques-kinétochore dans d'autres espèces.
Au cours des dernières années , de nombreuses études ont développé différents tests de microscopie quantitative pour les cellules fixes. 42 Progrès dans centromère-kinétochore biologie nécessite souvent une compréhension de la fonction centromère spécifique ou spécifique à kinétochore de protéines de laquelle la régulation spatio-temporelle subcellulaire reflète l'évolution des fonctions de ces protéines au cours du cycle cellulaire. Par conséquent, nous avons développé ici des pro…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le NIH subvention GM68418.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |