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Biologie

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

Published: March 03, 2016
doi:
10.3791/53732
,
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases,Nationwide Children’s Hospital

Summary

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Abstract

“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Introduction

"centromères" ont été classiquement définis comme régions de recombinaison méiotique supprimée en génétique et plus tard reconnu comme la constriction primaire des chromosomes mitotiques, qui joue un rôle essentiel dans la ségrégation des chromosomes lors de la mitose précise. "cinétochores" ont été décrits comme des structures à couches multiples qui se lient aux microtubules à la surface de centromères, telle qu'elle est révélée par microscopie électronique; "cinétochores" ont ensuite été définis comme étant le complexe macromoléculaire qui se localise au niveau du centromère des chromosomes mitotiques. En dépit d'une divergence considérable de séquences d'ADN centromériques parmi les vertébrés, la structure et la composition kinétochore sont hautement conservées. Une interaction dynamique entre microtubules du fuseau et kinétochore est nécessaire pour la ségrégation fidèle des chromosomes lors de la mitose, et les défauts de centromère-kinétochore fonction conduisent à une aneuploïdie et ainsi le cancer.

Centromère dans la plupart des eucaryotesa pas de séquence d'ADN définie, mais est composé de grands réseaux (0,3-5 Mo) d'ADN alphoïde répétitif constitué d'ADN α-satellite de 171 pb. Sauf dans la levure bourgeonnante, l' identité de centromère est obtenue non pas par la séquence d'ADN , mais par la présence d'un nucléosome spécial qui contient le variant de l' histone H3 CENH3 (centromère protéine A [CENP-A] chez l' homme). 5 nucléosomes CENP-A localisent au plaque intérieure de kinétochores mammifères 7 et se lient à l'ADN α-satellite de 171 pb. centromères actifs exigent CENP contenant A-nucléosomes pour diriger le recrutement d'un réseau constitutif centromère-associé (CCAN) et les protéines kinétochoriens, qui régulent ainsi l'attachement des chromosomes au fuseau mitotique et la progression du cycle suivant à travers le point de contrôle de la broche.

À la lumière de la preuve ci – dessus, CENP-A a été proposé d'être la marque épigénétique du centromère 8; toutefois, le processus par lequel CENP-A est incorporé into ADN centromérique et les facteurs responsables de cette incorporation ont pas encore été bien caractérisée. Un domaine de centromère ciblage courte (DTAC) réside dans le histone fold région CENP-A, et le remplacement de la région correspondante de H3 avec le CATD est suffisante pour H3 directe du centromère. 9 Plusieurs études ont suggéré des rôles fonctionnels pour post-traductionnelle modification (PTM) de CENP-A 12-16; Cependant, les mécanismes moléculaires de ces PTM de CENP-A dans le recrutement à centromères n'a pas encore été élucidé. Nous avons déjà indiqué que l' activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour CENP-A K124 ubiquitylation et la localisation de CENP-A à centromères 17.

La découverte et la caractérisation des protéines kinétochoriens ont conduit à de nouvelles connaissances en ce qui concerne la ségrégation des chromosomes. 18 Plus de 100 éléments kinétochoriens ont été identifiées dans les cellules de vertébrés par diverses approches. Une sous 19,20méthodes permanentes de la façon dont cinétochores assemblent et la fonction vient également de la caractérisation des fonctions cellulaires de chaque réseau centromère-kinétochore protéines et protéine-protéine dans les cellules. 19 visualisation directe et d' imagerie de pointe en microscopie de fluorescence fournissent remarquable résolution de composants centromère-kinétochore et permettent l'observation directe des composants moléculaires spécifiques des centromères et kinétochores. En outre, les méthodes d'immunofluorescence indirecte (IIF) coloration en utilisant des anticorps spécifiques sont cruciaux pour ces observations. Cependant, en dépit de nombreux rapports sur les protocoles IIF, peu abordés dans les problèmes de détail de protéines centromériques-kinétochore spécifiques. 1-4 Ainsi, le développement et les méthodes de déclaration de IIF coloration et un dosage quantitatif IIF pour analyser spécifiquement chaque protéine centromère-kinétochore est extrêmement important. Dans IIF coloration, il faut procéder avec le protocole de coloration pour éviter la perte de la protéine d'intérêt oule reste de la cellule. Cependant, la fixation détruit les sites antigéniques de temps en temps, et des combinaisons anticorps-antigène fonctionne mal avec un fixatif, mais très bien avec les autres, 21 et le choix de fixatif dépend en grande partie de la protéine (s) d'intérêt. Par conséquent, les différentes méthodes de fixateur sont cruciales dans IIF coloration des protéines centromériques-kinétochore.

Méthodes ici optimisées immunofluorescence indirecte (IIF), la coloration et un essai pour résoudre la localisation des protéines centromère kinétochore endogènes, y compris CENP-A et les protéines CENP-A exogènes étiquetée FLAG, et la quantification de ces protéines dans des cellules humaines ont été développées. Ces procédés peuvent être appliqués à l'analyse des protéines centromériques-kinétochore dans d'autres espèces.

Protocol

1. Culture cellulaire et transfection Mettez un couvercle en verre (22 mm x 22 mm) dans une plaque de polystyrène à 6 puits. manteau En option, un couvercle en verre avec Poly-L-lysine, 0,1% p / v, dans l'eau (voir la liste des matériaux / équipement) pour maintenir les cellules en mitose sur le couvercle en verre en suivant les étapes ci-dessous: Remarque: Les conditions optimales doivent être déterminées pour chaque lignée cellulaire et de l'application. Aseptique surface de…

Representative Results

L' analyse par immunofluorescence de CENP-A endogène soutient l'hypothèse que CUL4A-ligase E3 est nécessaire pour la localisation de CENP-A centromères Nos études récentes ont montré que l' activité de ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 est nécessaire pour ubiquitylation de la lysine 124 (K124) sur CENP-A et la localisation de CENP-A à centromères. 17 Initialement, le complexe interphase-centromère (ICEN) a été isolé …

Discussion

Au cours des dernières années , de nombreuses études ont développé différents tests de microscopie quantitative pour les cellules fixes. 42 Progrès dans centromère-kinétochore biologie nécessite souvent une compréhension de la fonction centromère spécifique ou spécifique à kinétochore de protéines de laquelle la régulation spatio-temporelle subcellulaire reflète l'évolution des fonctions de ces protéines au cours du cycle cellulaire. Par conséquent, nous avons développé ici des pro…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NIH subvention GM68418.

Materials

Lipofectamin 2000 Life Technologies/Invitrogen 11668 transfection reagent I
Lipofectamin RNAiMAX Life Technologies/Invitrogen 13778 transfection reagent II
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water 
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)  Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm) 
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well polystyrene plate 
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
PAP PEN  Binding Site AD100.1 Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining)
Paclitaxel (Taxol) SIGMA-SLDRICH T7402 Taxol for mitotic cell analysis
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) Enzo Life Sciences BML-T120 TN16 for mitotic cell analysis
BSA (bovine serum albumin) SIGMA-SLDRICH A7906 Blocking reagent
Triton X-100 SIGMA-SLDRICH T8787 Detergent for permeabilization
Paraformaldehyde SIGMA-SLDRICH P6148 Fixation reagant
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides 
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation)
Anti-CENP-B antibody  abcam ab25734 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation)
Anti-centromere antibody (ACA) Fitzgerald Industries International, Inc. 90C-CS1058 Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H antibody Bethyl Laboratories BL1112 (A400-007A) Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H antibody BD 612142 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I antibody N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 antibody Novus Biologicals NBP1-89223 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody Novus Biologicals / GeneTex NB 100-338 / GTX70268 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 antibody GeneTex GTX110735 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 antibody abcam ab46826 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)
Anti-Flag antibody SIGMA-ALDRICH F3165 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag antibody SIGMA-ALDRICH F7425 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A antibody N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibody Cell Signaling 4397 Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibody Chemicon MAB374 Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11001 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11012 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Skim milk
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope  Leica motorized fluorescence microscope 
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X oil immersion lens
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X oil immersion lens
Leica EL6000 compact light source Leica External compact light source for fluorescent excitation
ORCA-R2 Digital CCD camera  Hamamatsu C10600-10B digital CCD camera 
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software  Perkin Elmer/Improvision For image observation, acquisition, quantification, and analysis
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software  Perkin Elmer/Improvision For image observation, acquisition, quantification, and analysis
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001/11836170001 Protease inhibitor cocktail tablets
PlusOne 2-D Quant Kit Amersham Biosciences 80-6483-56 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS)
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Immobilon-FL EMD Millipore IPFL00010 PVDF membrane for transferring
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG LI-COR Biosciences 926-32210 IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-32221 IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 Fisher Scientific PI35507 DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-Rabbit DyLight 649 Fisher Scientific PI35565 DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF)
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz SC-2005 HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF)
Goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz SC-2004 HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software  Improvision/PerkinElmer Software A
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer Software B2
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc.  33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc.  33996-185 Microtip for sonication
Odyssey CLx Infrared imaging System  LI-COR Biosciences Infrared imaging system for immunoblot detection
Image Studio Analysis Software Ver 4.0  LI-COR Biosciences Software C
Molecular Imager Versadoc MP4000 System  Bio-Rad Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Quantity One 1-D analysis software  Bio-Rad Software D
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
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References

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Citer Cet Article
Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. J. Vis. Exp. (109), e53732, doi:10.3791/53732 (2016).
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