Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
必須金属は、二次メッセンジャー経路、代謝経路と細胞小器官機能を含む通常の生物学的機能、で重要な役割を果たしています。全タンパク質の30%が金属タンパク質1、全ての酵素2の50%であると考えられています。金属酵素は、化学反応を触媒するタンパク質の構造を安定化させるための補因子として、またこのような二次メッセンジャーとして調節の役割のためにこれらの微量金属を使用します。神経変性の点で最も研究微量元素の一部は、銅、鉄、亜鉛3です。これらはdyshomeostasisによって影響悪影響を有することができ、多くの疾患経路に関与すると考えられています。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)に直接影響を与える寿命と筋萎縮性側索硬化症(ALS)4の家族型のトランスジェニックマウスモデルの表現型の金属状態。アルツハイマー病では、metalloproteomics技術は、pにおけるトランスフェリンの金属状態の低下を検出するために使用されていますlasma 5。これらの研究は、金属タンパク質が病気で遊ぶことができる重要な役割を強調表示します。
直接生体組織から金属タンパク質の研究が発展フィールドです。いくつかの金属酵素が特徴づけられているが、大半はまだ特徴付けられていないか、6未知のままです。金属タンパク質を測定する際の主要な課題の一つは、タンパク質7の本来の状態を維持するための必要条件です。古典的なボトムアッププロテオミクス技術は、ペプチドへのタンパク質の消化に依存しています。このプロセスは、金属およびそれらのタンパク質の非共有結合相互作用を破壊します。したがって、タンパク質の金属状態についての情報は得られていません。
質量分析8,9(SEC-ICP-MS) -この問題を克服する一つの方法は、誘導結合プラズマと対にサイズ排除クロマトグラフィーを使用することです。これは、タンパク質のおおよそのサイズに関する情報と同様に連想されている任意の金属を生成し、それ10でiated。また、サイズ排除は、酵素やタンパク質 – タンパク質複合体の本来の状態を維持することができます穏やかなクロマトグラフィー技術です。誘導結合プラズマを使用することの一つの利点 – 質量分析法(ICP-MS)は、技術の定量的な性質です。金属タンパク質標準のセットを使用して、生物学的試料9,11の金属タンパク質の絶対定量を提供することが可能です。これは、金属濃度の範囲にわたって既知の金属タンパク質を注入することによって標準曲線を生成することによって達成されます。
このプロトコルは、これが金属タンパク質標準の様々な達成することができる方法の一例を示しています。本稿では、主に鉄(Fe)、銅(Cu)、亜鉛(Zn)、ヨウ素(I)、及びコバルト(Co)を含む生物学の分野で研究されている金属のための標準曲線を作成することを目指しています。
タンパク質の天然状態を確保することが使用され、サンプルの保存が必要とされるバッファへの特別な注意を意味します。すべてのクロマトグラフィー技術または試料調製技術を用いることができません。サンプル調製およびクロマトグラフィーを通して使用される緩衝液は、生理学的pHと塩濃度を模倣する金属キレート剤と使用バッファを欠いていることが重要です。回避するために、他の条件はタンパク質変性剤( 例えば 、尿素)のサンプルまたは付加を加熱することが含まれます。凍結融解サイクルの数を最小限にすることが重要です。二価金属を結合するための選択されたバッファの能力もまた重要であり、トリスまたは硝酸アンモニウムバッファは、リン酸ベースのバッファ上で選択されていることが理由です。
クロマトグラフィーの他の形態の低解像度およびサイズ排除クロマトグラフィーの相対ピーク容量は、この技術の主要な制限です。しかし、サイズ排除chromatograの、穏やかな性質PHYは、タンパク質の天然状態を維持し、比較的弱い金属 – タンパク質結合を維持することが重要です。タンパク質の天然状態を維持するための要件は、金属キレート剤( 例えば 、EDTA)またはカオトロピック塩や界面活性剤を避け、凍結融解サイクルの数を制限するなどのサンプルの治療に特別な注意が必要です。
この技術の影響のこの低解像度、それはもっとして一つのタンパク質が含まれています見たピークのような複雑なサンプルである場合、特定のタンパク質と結合した金属の量を定量する能力。したがって、ピーク積分を用いて決定された金属の量は、タンパク質の全てがひとつの特定のタンパク質をこの時点で溶出なく、関連付けられた金属の総量の指標です。この制限を克服するために、目的のタンパク質は、さらに、天然の条件下で精製されなければなりません。これは、の定量化を可能にしますこのタンパク質に関連付けられている金属はcertainity度の高い報告します。この技術の別の潜在的な制限は、カラムへの非可逆的結合にタンパク質の損失になります。カラムから溶出したタンパク質の量は、これは注入量と一致するかどうかを決定するために分析されるこの回復実験が起こっているかどうかを決定するために行われるべきです。同じことは、溶出材料の金属含有量とバルクICP-MSによって出発物質を測定することによって行うことができます。カラム回復は使用条件に応じて異なり得るが、サイズ排除カラムからのタンパク質の完全な回復が9可能であることが示されています。したがって、使用されている動作条件の下で損失があるか否かをチェックすることが重要です。
プロトコルへの変更を解析要素と同様に使用される金属タンパク質標準に関連付けることができます。金属タンパク質の標準的な私たちのタイプedは関心のある要素によって異なります。例えば、Cu、FeおよびZnのタンパク質などの要素については、SODおよびフェリチンが使用されます。 stoichometriesを知られている任意の他の金属タンパク質も使用することができ、いくつかの例がここに示されています。
この技術を使用してから生じ得る一つの主要な合併症は、ICP-MSのトーチで塩結晶の蓄積です。システムを通過したか、トーチを洗浄する必要があることを、目視検査によって判定された場合、バッファ1000mlの – 塩結晶の蓄積を防止するために、トーチは、すべての500の後、蒸留水で洗浄します。発生する可能性があるもう一つの問題は、サンプルと抽出コーンの清潔でより急速な低下です。これらは、製造者のプロトコルに従って、定期的に清掃する必要があります。
初期試料調製プロトコルの中で最も重要なステップです。金属錯体INF – タンパク質に変更がある場合生成されたormationは有効になりません。これは、技術の主要な制限の一つです。加えて、低解像度の使用は、サイズ排除カラムは、生物学における金属タンパク質の真の複雑さの制限された詳細図が得られます。
ここに記載された技術は、生物のmetalloproteomeの知識を拡張することができます。バルク分析は、サンプル内の金属の量の変化の粗製の指標を与えます。考慮する必要がある一般的な考慮事項に加えて、この技術は、得られたトレースを比較することによって、異なるタンパク質、ならびに特定金属タンパク質と関連する金属の量を定量するために使用できるツールを提供します。この技術の使用は、疾患状態の違いを識別するために使用することができます。識別された金属タンパク質は、その後さらに、彼らは疾患プロセスにおいて果たす役割を決定するのを助けるために調査することができます。ハイフネーションされたICP-MSの適用が成長していますICP-MSは、薬物が結合タンパク質を同定するために使用することができるように、白金、ヨウ素または銅などのヘテロ原子を有する薬剤の役割を決定するために将来。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム、(Agilent Technologies社との)オーストラリアの研究評議会リンケージプロジェクトスキーム、精神保健Neuroproteomicsのためのオーストラリア国立保健医療研究評議会、ビクトリア朝の脳バンク、共同研究センターから支援を感謝したいです施設。
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |