Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
Essentiella metaller spelar en viktig roll i normala biologiska funktioner, inklusive sekundära budbärare vägar, metabolism vägar och organell funktioner. 30% av alla proteiner tros vara metalloproteiner 1 och 50% av alla enzymer 2. Metalloenzymer använder dessa spårmetaller som kofaktorer att katalysera kemiska reaktioner, stabilisera proteinstruktur och för regulatoriska roller som sekundära budbärare. Några av de mest studerade spårelement i fråga om att neurodegeneration är koppar, järn och zink 3. De tros vara inblandade i många sjukdomsvägar där genom dyshomeostasis kan ha negativa effekter. Exempelvis metallstatus för superoxiddismutas (SOD) direkt påverkar livslängden och fenotyp av de transgena musmodeller av familjär typ av amyotrofisk lateralskleros (ALS) 4. Vid Alzheimers sjukdom, har metalloproteomics tekniker använts för att upptäcka en minskning av metallstatus för transferrin i pLasma 5. Dessa studier belysa den viktiga roll metalloproteiner kan spela i sjukdom.
Studien av metalloproteiner direkt från biologiska vävnader är ett växande. Även om vissa metalloenzymer har präglats, de flesta fortfarande karaktäriserad eller okänd 6. En av de stora utmaningarna att mäta metalloproteiner är kravet att upprätthålla det nativa tillståndet av proteinet 7. Klassisk bottom-up proteomik tekniker förlitar sig på nedbrytning av proteiner till peptider. Denna process stör icke-kovalent interaktion av metaller och deras proteiner. Således är ingen information om metall status av ett protein som gjorts.
Ett sätt att lösa detta problem är att använda gelkromatografi parat med induktivt kopplad plasma – masspektrometri 8,9 (SEC-ICP-MS). Detta genererar information om proteinets ungefärlig storlek samt eventuella metaller som associated med den 10. Vidare är storleksuteslutning en mild kromatografisk teknik som kan bevara den nativa tillstånd av ett enzym eller protein-proteinkomplex. En fördel med att använda induktivt kopplad plasma – masspektrometri (ICP-MS) är den kvantitativa naturen hos teknologin. Med användning av en uppsättning av metalloproteiner standarder är det möjligt att åstadkomma absolut kvantifiering av metalloproteiner från biologiska prover 9,11. Detta uppnås genom att generera en standardkurva genom att injicera kända metalloproteiner över ett område av metallkoncentrationer.
Detta protokoll visar ett exempel på hur detta kan åstadkommas för en mängd olika metalloprotein standarder. I denna uppsats vill vi skapa standardkurvor för metaller som till stor del undersöks i biologiska områden, inklusive järn (Fe), koppar (Cu), zink (Zn), jod (I), och kobolt (Co).
Säkerställa det nativa tillståndet av proteinet innebär särskild uppmärksamhet åt buffertar används och lagring av provet behövs. Inte kan användas alla kromatografiska tekniker eller provberedningstekniker. Det är viktigt att de buffertar som används i hela beredningen och kromatografi prov saknar metallkelatorer och använda buffertar som efterliknar fysiologiska pH och saltkoncentrationer. Andra villkor för att undvika inkluderar uppvärmning provet eller tillsats av proteindenatureringsmedel (t.ex. urea). Det är kritiskt att minimera antalet av fryst tiningscykler. Förmågan hos den valda bufferten för att binda tvåvärda metaller är också viktig och är en anledning till att Tris eller ammoniumnitrat buffertar väljs över fosfatbaserade buffertar.
Den låga kapaciteten för storleksuteslutningskromatografi i förhållande till andra former av kromatografi upplösning och topp är en viktig begränsning av denna teknik. Men den milda karaktär storleksuteslutande chromatograPHY är viktigt att upprätthålla det nativa tillståndet av proteinet och därmed bevara de relativt svaga metall-proteinbindningar. Kravet på att hålla det nativa tillståndet av proteinerna kräver särskild uppmärksamhet på behandlingen av proverna, inklusive begränsa antalet frysupptiningscykler, undvika metallkelatorer (t.ex. EDTA) eller kaotropiska salter och rengöringsmedel.
Denna låg upplösning av denna teknik påverkar förmågan att kvantifiera mängden metall associerad med ett specifikt protein, om det är i ett komplext sampel som topparna som ses kommer att innehålla mer än ett protein. Därför skulle mängden metall bestämdes med användning av toppintegrering vara en indikation på den totala mängden metall associerad med alla proteinerna eluerades vid denna tidpunkt och inte bara ett specifikt protein. För att övervinna denna begränsning proteinet av intresse skulle behöva renas ytterligare under nativa betingelser. Detta skulle göra det möjligt för kvantifiering avmetallen i samband med detta protein som ska rapporteras med en högre grad av certainity. En annan potentiell begränsning av denna teknik skulle vara förlust av protein på grund av icke reversibel bindning till kolonnen. I syfte att bestämma om detta sker en återhämtnings försök bör genomföras varigenom mängden av protein eluerades från kolonnen analyseras för att avgöra om detta motsvarar storleken på injiceras. Samma sak kan göras genom att mäta metallhalten av elueringen material och utgångsmaterialet genom bulk ICP-MS. Kolumn återhämtning kan variera beroende på de betingelser som används, men det har visat sig att fullständig återhämtning av proteiner från en storleksuteslutningskolonn är möjligt nio. Därför är det viktigt att kontrollera om det finns någon förlust under driftsförhållanden som används.
Ändringar i protokollet kan relateras till de metalloprotein standarder som används samt de delar analyseras. Den typ av metalloprotein standard ossEd kommer att variera beroende på faktorer som är av intresse. För element, såsom Cu, Fe och Zn proteiner, SOD och ferritin användes. Någon annan metalloprotein som har kända stoichometries kan också användas och några exempel har visats här.
En stor komplikation som kan uppstå från att använda denna teknik är att bygga upp saltkristaller i fackla ICP-MS. För att förhindra uppbyggnad av saltkristaller, är brännaren tvättades med destillerat vatten efter varje 500 – 1000 ml buffert som har passerat genom systemet eller när det bestäms genom visuell inspektion att brännaren bör rengöras. Ett annat problem som kan uppstå är en snabbare nedgång i städning av prov- och utvinning koner. Dessa måste rengöras regelbundet enligt tillverkarens protokoll.
Den initiala provberedningen är det mest kritiska steget i protokollet. Om det finns några ändringar i proteinet – metallkomplexet infFörnyelsen som genereras kommer inte att gälla. Detta är en av de viktigaste begränsningarna hos den teknik; förutom användningen av den låga upplösningen, ger storleksuteslutningskolonn en begränsad detaljerad vy av den sanna komplexitet metalloproteiner i biologi.
Den teknik som beskrivs här tillåter expansion av kunskap om den metalloproteome av en organism. Bulk analys ger endast en rå indikation på förändringar i mängden metall i ett prov. Förutom de allmänna överväganden som måste beaktas, ger denna teknik ett verktyg som kan användas för att kvantifiera mängden metall i samband med proteiner samt identifiera metalloproteiner som skiljer sig genom att jämföra spår erhållits. Användningen av denna teknik kan användas för att identifiera skillnader mellan sjukdomstillstånd. De identifierade metalloproteiner kan sedan undersökas vidare för att avgöra vilken roll de spelar i sjukdomsprocesser. Tillämpningen av bindestreck ICP-MS har en växandeframtiden för att fastställa rollen för droger som har en heteroatom såsom platina, jod eller koppar som ICP-MS kan användas för att identifiera de proteiner som läkemedlet binder.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för stödet från viktorianska regeringens operativa Infrastruktur Support Program, Australian Research Council länknings Projekt Scheme (med Agilent Technologies), Australian National Health och Medical Research Council, den viktorianska hjärnan bank, Cooperative Research Centre för psykisk hälsa och Neuroproteomics anläggning.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |