酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
このプロトコルは、ヘテロキシランのグリコシル配列（単数または複数）を終了（RE）を低減し、内部領域の特徴付けのために使用される具体的な手法について説明します。脱糊小麦胚乳細胞壁は、アルコール不溶性残留物（AIR）1として単離し、順次水（W-ゾルFR）で抽出し、Ratnayake らによって記載されているように、1％のNaBH 4（KOH-ゾル金曜日）を含む1 M KOH ら （2014年）2。 2つの異なるアプローチは、（ 図1の概要を参照）を採用しています。最初に、インタクトなW-ゾルAXSは、元のRE主鎖糖残基にタグを2ABで処理し、次いで、それぞれ、オリゴ糖の還元2AB標識REと内部領域との混合物を生成するためのエンドキシラナーゼで処理しました。第2のアプローチでは、KOH、ゾルFRが最初に、続いて2ABで標識されたオリゴ糖の混合物を生成するために、エンドキシラナーゼで加水分解されます。両方から酵素的に放出（（非）タグ付けされた）オリゴ糖W-及びKOHゾルFRSは、MALDI-TOF-MS、RP-HPLC-ESI-QTOF-MSおよびESI-MS nの組み合わせを用いて実行されるその後のメチル化との両方の天然及びメチル化オリゴ糖の詳細な構造解析です。エンドキシラナーゼは、KOH、ゾルAXSもまた、アノマーの設定に関する情報を提供し、核磁気共鳴（NMR）によって特徴付けられる消化しました。これらの技術は、適切なエンドヒドロラーゼを用いた多糖の他のクラスに適用することができます。
Introduction
ヘテロキシランは、草の主壁とすべての被子植物3-6の二次壁の主要な非セルロース多糖類である多糖類のファミリーです。キシランの骨格は、その種類及びグリコシル（グルクロン酸（グルクロン酸）、アラビノース（ARAF））および非グリコシル（O-アセチル、フェルラ酸）の組織型、発生段階および種7に応じ残基の置換パターンが異なります。
小麦の壁は（ コムギ L.）の胚乳は、主にアラビノキシラン（AXS）（70％）と、（1→3）で構成されている（1→4）-β-D-グルカン（20％）、セルロースおよびheteromannansの少量で（2％ずつ）8。キシランバックボーンは、主に（主にO-2位およびより少ない程度にO-3位）置換モノおよびジ置換α-L-アラと（O-2およびO-3位）様々-未置換であってもよいですF残基9。ヘテロの還元末端（RE）（例えば、トウヒ（ ドイツトウヒ ））（例えば、 シロイヌナズナ ）双子葉植物からキシラン10と裸子植物11は、特徴的な四糖のグリコシル配列を含みます。 -β-D-XYL のp – （1→3）-α-L-RhaでのP – （1→2）-α-D-GalのP A-（1→4）-D-XYL pを。 （生物学的および工業用）ヘテロキシランの生合成と機能を理解するには、完全なタイプと置換のパターンだけでなく、還元末端（RE）のシーケンスを理解するためにキシランの骨格の配列を決定することが重要です。
端部（RE）とヘテロキシランの内部領域のグリコシル配列を低減する構造的特徴のために使用される特定の技術は、この原稿に記載されています。技術は、酵素（エンドキシラナーゼ）加水分解する前にヘテロキシラン鎖の還元末端（RE）（2アミノベンズアミド（2AB）で）タギングフォアに依存しています。特にRE配列決定のためのこのアプローチは、ました最初のニューヨーク研究所10,12-13によって報告されたが、現在は内部領域のシーケンシングを含むように拡張および分離のそのソースに関係なく、すべてのヘテロキシランにも等しく適用可能である確立された技術の組み合わせです。このアプローチは、（利用可能な）適切なエンドヒドロラーゼを用いた多糖の他のクラスに適用することができます。
説明したように、本 研究では、脱糊小麦胚乳細胞壁は、アルコール不溶性残留物（AIR）として単離し、順次水（W-ゾルFR）で抽出し、1MのKOHを、1％のNaBH 4（KOH-ゾル金曜日）を含みますRatnayakeでら （2014年）2。 FRSは、次に、メチル化され、両方のネイティブとメチル化オリゴ糖の詳細な構造分析は高速液体クロマトグラフィーを用いて、MALDI-TOF-MSの組み合わせを用いて実行ESI-QTOF-MS結合さW-及びKOH、ゾルの両方から放出されたオリゴ糖RP C-18カラムを使用してオンラインクロマトグラフィー分離およびESI-MS nを。エンドキシラナーゼは、KOH、ゾルAXSは、核磁気共鳴（NMR）によって特徴づけられた消化しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ほとんどのマトリックス相の細胞壁多糖類は、一見ランダムに植物種、発達段階および組織型3に応じて、非常に多様である（グリコシルおよび非グリコシル残基の両方を含む）の骨格を置換しています。多糖類は、第二の遺伝子産物であるので、それらの配列は、派生テンプレートされておらず、そのような彼らの配列決定のために、核酸およびタンパク質のために存在するとして?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
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