Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Este protocolo descreve as técnicas específicas utilizadas para a caracterização de reduzir extremidade (RE) e a sequência de glicosilo região interna (s) de heteroxilanos. As paredes celulares do endosperma do trigo de-engomados foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) 1 e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e 1 M de KOH contendo 1% NaBH4 (KOH-Sol Fr) como descrito por Ratnayake et al. (2014) 2. Duas abordagens diferentes (ver o resumo na Figura 1) são adotados. No primeiro, AXs W-Sol intactas são tratados com 2AB para marcar o RE espinha dorsal resíduo de açúcar cadeia original e, em seguida, tratada com uma endoxilanase para gerar uma mistura de RE marcado com 2AB região interna e reduzindo oligossacidos, respectivamente. Numa segunda abordagem, o FR-Sol KOH é hidrolisado com endoxilanase a primeira geração de uma mistura de oligossacáridos, que são, subsequentemente, rotulados com 2AB. Os enzimaticamente liberados ((ONU) tag) oligossacarídeos de ambosW- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada de ambos os oligossacáridos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, de RP-HPLC-ESI-MS e QTOF-ESI-MS n. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs são também caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) que também fornece informações sobre a configuração anomérica. Estas técnicas podem ser aplicadas a outras classes de polissacáridos, utilizando os endo-hidrolases adequadas.
Introduction
Heteroxilanos são uma família de polissacarídeos que são predominantes os polissacáridos não celulósicas das paredes primárias de gramíneas e as paredes secundárias de todas as angiospérmicas 3-6. Os backbones xylan diferem em seus tipos e padrões de substituição com glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinose (Araf)) e de resíduos, dependendo do tipo de tecido, estágio de desenvolvimento e de espécies não-7 glicosilo (O-acetil, ácido ferúlico).
Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endosperma são compostos principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) glucanos -β-D-(20%) com quantidades menores de celulose e heteromannans (2% cada) 8. A espinha dorsal xilano pode ser variadamente não-substituído e predominantemente mono-substituído (principalmente O-2 posição e, em menor extensão O na posição 3) e (O-2 e O-3 posições) com α-L-Ara di-substituído F 9 resíduos. A extremidade redutora (RE) de heteroxilanas de dicotiledóneas (por exemplo, de Arabidopsis thaliana 10) e gimnospermas (por exemplo, abeto vermelho (Picea abies) 11) contém uma sequência de tetrassacárido glicosilo característicos; -β-D-Xil P – (1 → 3) -α-L-Rha P – (1 → 2) -α-D-Gal P A- (1 → 4) -D-Xil p. Para compreender a biossíntese e função (biológica e industrial) heteroxylan, é importante para sequenciar completamente a espinha dorsal xilano de compreender os tipos e os padrões de substituição, bem como a sequência da extremidade redutora (RE).
As técnicas específicas utilizadas para a caracterização estrutural de redução final (RE) e sequência glicosil região interna (s) de heteroxilanos são descritos neste manuscrito. As técnicas dependem de fluoróforo marcação (com 2 aminobenzamida (2AB)) na extremidade redutora (RE) da cadeia heteroxylan antes enzimática (endoxilanase) hidrólise. Esta abordagem, em particular para a sequenciação RE, estavaprimeiro reportados pelo laboratório Iorque 10,12-13 mas agora é alargado para incluir a sequência e a região interna é uma combinação de técnicas estabelecidas que é igualmente adaptável a todos os heteroxilanos, independentemente da sua fonte de isolamento. Esta abordagem também pode ser aplicada a outras classes de polissacáridos usando (quando disponíveis), os endo-hidrolases adequadas.
No presente estudo, as paredes celulares do endosperma do trigo engomado-de foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e KOH 1M contendo 1% de NaBH 4 (KOH-Sol Fr) como descrito em Ratnayake et al. (2014) 2. Os oligossacidos libertados de ambos W- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada dos oligossacidos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, ESI-MS-QTOF-acoplado com HPLC, com a separação cromatográfica utilizando uma linha de RP C-18 de colunae n ESI-MS. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs também foi caracterizado por ressonância magnética nuclear (RMN).
Protocol
Representative Results
Discussion
A maioria dos polissacáridos da parede celular fase de matriz têm aparentemente de forma aleatória espinhas dorsais substituído (com ambos glicosilo e resíduos de não-glicosilo) que são altamente variáveis dependendo da espécie de planta, fase de desenvolvimento e tipo de tecido 3. Desde polissacarídeos são produtos de genes secundários sua sequência não é modelo de derivados e não há, portanto, nenhuma abordagem analítica única, como existe para os ácidos nucléicos e proteínas, po…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
