This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Этот протокол описывает конкретные методы, применяемые для характеристики восстанавливающего конца (RE) и последовательность гликозильную внутреннюю область (и) heteroxylans. Де-крахмальные стены эндосперме пшеницы клеток выделяли в виде спиртовой нерастворимого остатка (AIR) 1 и последовательно экстрагировали водой (W-SOL Fr) и 1 М КОН , содержащем 1% NaBH 4 (KOH-SOL Fr) , как описано Ратнаяке ЕТ и др. (2014) 2. Два разных подхода (см резюме на рисунке 1) принимаются. В первом случае, интактные W-SOL AXS обрабатывают 2ab помечать исходную RE основной цепи остаток сахара, а затем обрабатывают эндоксиланазой, чтобы сформировать смесь 2ab меченных RE и внутренней области восстановительной олигосахариды, соответственно. Во втором подходе, KOH-золь ПТ гидролизуется с эндоксиланазой сначала подготовить смесь олигосахаридов, которые впоследствии меченных 2ab. В ферментативно выпустили ((ООН) отмеченном) олигосахариды с обеихW- и KOH-SOL Frs затем метилированной и детальный структурный анализ как нативных , так и метилированных олигосахаридов производится с использованием комбинации MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-МС и ESI-MS п. Эндоксиланазой переваривается KOH-золь AXS также характеризуются ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которая также предоставляет информацию о конфигурации аномерного. Эти методы могут быть применены к другим классам полисахаридов с использованием соответствующих эндо-гидролазы.
Heteroxylans представляют собой семейство полисахаридов , которые являются преобладающими нецеллюлозные полисахариды первичных стенок трав и вторичных стенок всех покрытосеменные 3-6. Ксилана магистральные сети различаются по типам и моделей замещения с гликозил (глюкуроновой кислоты (GlcA), арабинозы (Араф)) и не гликозил (O-ацетил, феруловая кислота) остатки в зависимости от типа ткани, стадии развития и видов 7.
Стены из пшеницы (Triticum AESTIVUM L.) , эндосперма состоят в основном из арабиноксиланов (AXS) (70%) и (1 → 3) (1 → 4) -β-D-глюкан (20%) с небольшими количествами целлюлозы и heteromannans (2% каждый) 8. Ксилана цепь может быть различным образом ун-замещенные и преимущественно монозамещенным (в основном O-2 положении и в меньшей степени, O-3-положении) и ди-замещенные (O-2 и O-3 позиции), с & alpha; -L-Ara F остатки 9. Восстанавливающий конец (RE) гетеросвязейксиланы из двудольных (например, Резуховидка Таля) 10 и голосеменных (например, ель (Picea пихта)) 11 содержит характерную последовательность тетрасахарид гликозильную; -β-D-Xyl р – (1 → 3) -α-L-Rha р – (1 → 2) -α-D-Gal р А- (1 → 4) -D-Xyl р. Чтобы понять heteroxylan биосинтез и функции (биологической и промышленных), важно, чтобы полностью секвенировать ксилана позвоночник, чтобы понять типы и образцы замен, а также последовательность восстанавливающего конца (RE).
Конкретные методы, используемые для структурной характеристики восстанавливающего конца (RE) и последовательность гликозильную внутреннюю область (и) heteroxylans описаны в этой рукописи. Методы полагаются на флуорофора мечения (с 2 аминобензамидом (2ab)) восстанавливающий конец (RE) в heteroxylan цепи предшествующего уровня ферментативной (эндоксиланазой) гидролиза. Такой подход, в частности, для РЗ последовательности, быловпервые сообщили в лаборатории – Йорк 10,12-13 , но теперь расширена , чтобы включить внутреннюю область секвенирование и представляет собой сочетание установленных методов , которые в равной степени адаптированы ко всем heteroxylans независимо от их источника изоляции. Этот подход может быть также применен к другим классам полисахаридами, используя (если таковые имеются) соответствующие эндо-гидролазы.
В настоящем исследовании, де-накрахмален стены эндосперме пшеницы клеток выделяли в виде спиртовой нерастворимого остатка (воздух) и последовательно экстрагируют водой (W-золь Fr) и 1 М КОН , содержащем 1% NaBH 4 (КОН-SOL Fr) , как описано в Ратнаяке и др. (2014) 2. Освобожденные олигосахариды с обеих W- и KOH-SOL Frs затем метилированной и детальный структурный анализ как нативных, так и метилированных олигосахаридов производится с использованием комбинации MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-МС-в сочетании с ВЭЖХ с онлайн хроматографическое разделение с использованием с-18 колонке RPи ESI-МС п. Эндоксиланазой переваривается КОН-золь AXS характеризовался также ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Большинство фазы матрицы полисахаридами клеточной стенки имеют по- видимому случайным образом замещенные основные цепи (с обоими гликозильная и не Гликозильные остатков) , которые сильно варьируют в зависимости от вида растений, стадии развития и типа ткани 3. Поскольку полисаха…
The authors have nothing to disclose.
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
(ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |