Sekvensering av växt Wall Heteroxylans Använda enzym, Chemical (metylering) och fysiska (masspektrometri, kärnmagnetisk resonans) Tekniker
Summary
This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).
Abstract
Detta protokoll beskriver de specifika tekniker som används för karakteriseringen av reducerande änden (RE) och inre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans. De-stärkta vete frövitan cellväggar isolerades såsom en alkohol-olöslig återstod (AIR) 1 och sekventiellt extraherades med vatten (W-sol Fr) och 1 M KOH innehållande 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) såsom beskrivits av Ratnayake et al. (2014) 2. Två olika metoder (se sammanfattningen i figur 1) har antagits. I det första, är intakta W-sol AXS behandlades med 2AB att märka den ursprungliga RE huvudkedjan sockerrest och behandlas sedan med en endoxylanas för att generera en blandning av 2AB-märkt RE och inre område reducerande oligosackarider, respektive. I ett andra tillvägagångssätt, är den KOH-sol Fr hydrolyseras med endoxylanas att först generera en blandning av oligosackarider, vilka därefter märkta med 2AB. De enzymatiskt frigjorda ((un) taggade) oligosackarider från bådaW och KOH-sol Frs därefter metylerade och den detaljerade strukturanalys av både inhemska och metylerade oligosackarider utförs genom att använda en kombination av MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS och ESI-MS n. Endoxylanas diger KOH-sol AXS kännetecknas också av kärnmagnetisk resonans (NMR) som också ger information om den anomera konfigurationen. Dessa tekniker kan appliceras på andra klasser av polysackarider med användning av de lämpliga endo-hydrolaser.
Introduction
Heteroxylans är en familj av polysackarider som är de dominerande icke-cellulosahaltiga polysackarider av de primära väggar gräs och de sekundära väggarna i alla angiospermer 3-6. Xylan huvudkedjor skiljer sig åt i deras typer och mönster av substitution med glykosyl (glukuronsyra (GlcA), arabinos (Araf)) och icke-glykosyl (O-acetyl, ferulasyra) rester beroende på vävnadstyp, utvecklingsstadium och arter 7.
Väggar från vete (Triticum aestivum L.) endosperm främst består av arabinoxylaner (AXS) (70%) och (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glukaner (20%) med mindre mängder av cellulosa och heteromannans (2% vardera) 8. Xylan ryggraden kan vara på olika un-substituerad och övervägande mono-substituerad (primärt O-2 positionen och i mindre utsträckning O-3-position) och di-substituerade (O-2 och O-3 positioner) med α-L-Ara f resterna 9. Den reducerande änden (RE) av heteroxylaner från dikotyledoner (t.ex. Arabidopsis thaliana) 10 och gymnospermer (t.ex. gran (Picea abies)) 11 innehåller en karakteristisk tetrasackarid glykosyl-sekvens; -β-D-Xyl p – (1 → 3) -α-L-Rha p – (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl s. Att förstå heteroxylan biosyntes och funktion (biologisk och industriell), är det viktigt att fullständigt sekvensera xylan ryggraden att förstå vilka typer och de mönster av substitutioner såväl som sekvensen för den reducerande änden (RE).
Specifika metoder som används för den strukturella karakteriseringen av reducerande ände (RE) och inre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans beskrivs i detta manuskript. Teknikerna är beroende av fluoroforen märkning (med två aminobensamid (2AB)) den reducerande änden (RE) i heteroxylan kedjan före enzymatisk (endoxylanas) hydrolys. Detta tillvägagångssätt, särskilt för RE sekvensering, varrapporterades först av York laboratorium 10,12-13 men nu utvidgas till att omfatta inre regionen sekvensering och är en kombination av etablerade tekniker som är lika anpassningsbar till alla heteroxylans oberoende av deras källa till isolering. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på andra typer av polysackarider med hjälp av (i förekommande fall) lämpliga endo-hydrolaser.
I föreliggande studie, var de-stärkta vete frövitan cellväggar isolerades som en alkohol-olöslig återstod (AIR) och sekventiellt extraherades med vatten (W-sol Fr) och 1 M KOH innehållande 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) såsom beskrivits i Ratnayake et al. (2014) 2. De frigjorda oligosackariderna från både W- och KOH-sol Frs är därefter metylerade och den detaljerade strukturanalys av både de nativa och metylerade oligosackarider utförs med användning av en kombination av MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-kopplad med HPLC med online-kromatografisk separation med användning av en RP C-18-kolonnoch ESI-MS n. Endoxylanas diger KOH-sol AXS präglades också av kärnmagnetisk resonans (NMR).
Protocol
Representative Results
Discussion
De flesta matris fas cellväggs polysackarider har till synes slumpmässigt substituerade ryggrader (med både glykosyl och icke-glykosylrester) som är mycket varierande beroende på växtarter, utvecklingsstadium och vävnadstyp 3. Eftersom polysackarider är sekundära genprodukter deras sekvens inte mall härledd och det finns därför ingen enskild analytisk metod, såsom finns för nukleinsyror och proteiner, för deras sekvensering. Tillgången på renade kopplingsspecifika hydrolytiska enzymer har get…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by funds from Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, provided to the High Fibre Grains Cluster via the Food Futures Flagship. AB also acknowledges the support of an Australia Research Council (ARC) grant to the ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).
Materials
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model – MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A., Preiss, J. . The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. 14, 297-371 (1988).
- York, W. S., O’Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis – which end is up?. Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- . . Agilent MassHunter Workstation Software – Quantitative Analysis Familiarization Guide. , (2010).
- . . Topspin User Manual. , (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements —-4)[alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—- or —-4)[alpha- L-Araf-(1—-2)][alpha-L-Araf-(1—-3)]-beta-D-Xylp-(1—-. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
