Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em> Plasmodium</em> Sporozoitler
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Plasmodium sporozoit aşaması bir sivrisinek ağzın içinden bir memeli konakçının derisine inoküle edildiğinde sıtma enfeksiyonu başlar. son derece hareketli parazit sadece hepatositler istila ve eritrosit-enfektif forma dönüşme karaciğere ulaşır. Aynı zamanda deri içine ve tanınan ve ikamet ve / veya işe miyeloid hücreleri tarafından bozulmuş olabilir enjeksiyon yerinde, drene yakın lenf nodu geçirir. Intravital görüntüleme parlak floresan Lys-GFP pozitif cilt lökositler ve lenf düğümünde sporozoitlerle ve CD11c'nin + hücreler arasındaki etkileşimlerin erken işe bildirdi. Biz burada, kurtarmak belirlemek ve fare cilde işe ve bir fare modelinde sporozoitlerine dozlarının immünizasyon intradermal enjeksiyonu takiben lenf nodu tüketiyor miyeloid hücre alt grupları numaralandırmak için verimli bir prosedür mevcut. Fenotipik karakterizasyonu kullanarak çok parametrik akış sitometri sağlargüvenilir bir tahlil Plasmodium enfeksiyona inflamatuar yanıt sırasında erken dinamik hücresel değişiklikler değerlendirmek.
Introduction
Sıtma her yıl yarım milyondan fazla kişi öldü dünyanın en ölümcül bulaşıcı hastalıklardan biridir. Plasmodium hastalığın nedensel maddesi ile enfeksiyon, bir eritrositik öncesi (PE), faz başlar. Bu aşamada, bir dişi anopheline türü sivrisinek tarafından konak deriye enjekte sporozoitler kan yoluyla karaciğere ulaşır ve hastalığın belirtilerini kırmızı kan hücreleri enfekte ve neden parazit formları içine iç hepatositler ayırt.
Plasmodium PE aşamaları, anti-sıtma aşısı için ayrıcalıklı bir hedef temsil etmektedir. Nitekim, bu tür radyasyon zayıflatılmış sporozoitlerle (RAS) olarak bu aşamaların karşı zayıflatılmış aşılar, canlı, genetik tutuklandı parazitler (GAP) ya da kemoprofilaksi ve sporozoitler (CPS) kemirgen ve insan ana 1-9 hem korumak için kapasitelerini ortaya koymuşlardır. kemirgen modelinde, çok aşılama çalışmaları intravenöz bağışıklık kullanılarak yürütülmektedirKoruyucu etkinlik açısından altın standart hangi. Ancak, cilt aşamasında tanımı ve koruması sağlamaya cilt ilişkili lenf düğümüne (DLN) önemi PE aşaması algı değişti ve enjeksiyon intradermal yolunun önemini vurgulamıştır. P. Intravital görüntüleme kemirgen derisine enjekte berghei sporozoitler aşı sadece ~% 25 kan yoluyla karaciğer ulaşır göstermiştir. ~ Geri kalan% 75, küçük bir oranda deri hücrelerinin 12,13 içinde haftalarca canlı dönüştürmek ve kalabilir proksimal dLn (~% 15) ve cilt (~% 50) 10,11 arasında dağıtır. Ayrıca, daha sonraki çalışmalarda, intradermal aşılamadan sonra etkin koruyucu bağışıklık kurulması özellikle parazit spesifik CD8 + T hücreleri, aktive deri dLn, yer alır ve sadece marjinal karaciğer veya dalak-dLNs 14,15 bu tarif.
İkençalışmaların çoğu koruyucu bağışıklık yanıtının kurulmasında rol efektör hücrelerin karakterizasyonu üzerine yoğunlaşmıştır, çok daha az doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile özellikle etkileşimleri, deri içine enjekte canlı zayıflatılmış parazitlerin akıbeti hakkında bilinmektedir. Özel olarak, CD8 + T hücreleri için, parazit antijen alımı, işleme ve sunumunda rol alan antijen sunan hücreler karakterizasyonu PE antijen alıcı deri ve dLn bölümlerinde hem oluşabilir bilerek kritik önem taşımaktadır. Önceki intravital görüntüleme çalışmaları sporozoitler ve dendritik hücreler arasındaki ilk etkileşimler dLn 10,17 gözlenmiştir ise enfeksiyon sivrisinek ısırığı 16 Aşağıdaki deri, parlak floresan Lys-GFP pozitif hücrenin erken akışını tarif. Daha yakın zamanda, sivrisinekler tarafından deri aşılanmış sporozoitler deri hem de dendritik ve düzenleyici T hücrelerinin hareketliliği artırdığı bildirilmiştirfareler, antijen sunan hücre bir azalma sayısı dLn 18 gözlenmediğini gösterdi.
Belirlemek ve daha kesin olarak, lökosit alt kümelerini cilt alınmış ve RAS 19 dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben parazit ile etkileşim gibi da dLn gelen ölçmek için amaçlanmıştır. Bu bağlamda, her iki dokulardan miyeloid hücreler (CD45 + CD11 +) izole edilmiş ve sitometrisi = çoklu parametre akış ilgi subpopülasyonunun karakterize edilir. Leishmania majör deri enfeksiyonu 20 erken evrede açıklanan immün yanıt ile tutarlı, enjeksiyon sporozoitlerden birincil konak yanıtı inflamatuar monositler (CD45 + CD11 b takip polimorfonükleer nötrofillerin (CD45 + CD11 b + Ly6G + Ly6C int) bir ardışık işe oluşur + Ly6G – differenti temelinde tanımlanan Ly6C +)Ly6G ve Ly6C yüzey belirteçleri al ifadesi.
Farenin deri miyeloid hücrelerin izole edilmesi ve dLn enfekte sivrisinek tükürük bezlerinden ekstre RAS dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben burada bir protokol açıklar. Tekrarlanabilir intradermal enjeksiyonları ve doku işleme enfekte dokular içinde hücre popülasyonu infiltre fenotipik değişiklikleri ölçmek için kritik adımlar vardır. Aşağıda ayrıntılı bir yaklaşım güvenilir bir deney Plasmodium paraziti cildin ve dLn enflamatuar tepkiyi değerlendirmek için çeşitli deney sistemlerinde uzatılabilir içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bütün sporozoit sıtma aşısı kullanan insanların büyük ölçekli aşılama perspektifinde, üstesinden gelmek için ana sorunlardan biri başarılı bağışıklama ve koruma 24,25 sağlamak için optimize yolları ve parazit uygulama yöntemlerini geliştirmektir. İnsanlarda, canlı azaltılmış parazitler (LAP) tarafından aracılık edilen koruyucu etkinlik değerlendirilmesi doğal sivrisinek takip gerçekleştirilmiştir 2, hem de intradermal, deri altı 25,26 ve IV'ü…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar fare derisinde sporozoit motilite in vivo görüntüleme öğretim için resim ve Pauline Formaglio alarak yardım için Patricia Baldacci, Vanessa Lagal ve Sabine Thiberge eleştirel okuma, Irina Dobrescu ve Sabine Thiberge teşekkür ederiz. Biz de sivrisinek yetiştirme için Üretim ve Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) ve Enfeksiyon için Marek Szatanik ve Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Laboratoire d'Excellence "Infectious Diseases Yükselen ve Bütünleştirici Biyoloji" den AXA Araştırma Fonu ve fonlar tarafından desteklenmiştir (no. ANR-10-LabX-62-IBEID hibe).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
