Myeloid Cell Isolation fra Mouse Hud og drænende lymfeknude Efter Intrakutan Vaccination med levende svækket<em> Plasmodium</em> sporozoitter
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Malaria infektion begynder, når sporozoit fase af Plasmodium inokuleres i huden af en pattedyrvært gennem en myg bide. Den meget bevægelige parasit ikke kun når leveren at invadere hepatocytter og omdanne til erythrocyt-infektiøse formular. Den vandrer også ind i huden og til den proksimale lymfeknude dræne injektionsstedet, hvor det kan blive anerkendt og nedbrydes af hjemmehørende og / eller rekrutteret myeloide celler. Intravital billeddannelse rapporterede tidlig rekruttering af lyst fluorescerende Lys-GFP-positive leukocytter i huden og samspillet mellem sporozoiter og CD11c + celler i drænende lymfeknude. Vi præsenterer her en effektiv procedure for at komme sig, identificere og opregne de myeloide celle delmængder, der er rekrutteret til musen hud og drænende lymfeknude efter intradermal injektion af immunisering doser af sporozoiter i en musemodel. Fænotypisk karakterisering ved hjælp af multi-parametrisk flowcytometri giveren pålidelig analyse for at vurdere tidlige dynamiske cellulære ændringer under inflammatoriske respons på Plasmodium infektion.
Introduction
Malaria er en af de dødeligste infektionssygdomme i verden, dræbte mere end en halv million mennesker om året. Infektion med Plasmodium, den kausale agens af sygdommen, begynder med en pre-erythrocytkoncentrationen (PE) fase. Under denne fase, sporozoiter injiceret i værtens hud ved en kvindelig Anopheline myg når leveren via blodbanen og differentiere inde hepatocytter i parasitten former, der inficerer røde blodceller og forårsage symptomerne på sygdommen.
De PE stadier af Plasmodium udgør et privilegeret mål for anti-malaria vaccination. Faktisk levende svækkede vacciner mod disse faser, såsom stråling svækkede sporozoiter (RAS), har genetisk arresterede parasitter (GAP) eller kemoprofylakse og sporozoiter (CPS) demonstreret deres evne til at beskytte både gnavere og menneskelige værter 1-9. I gnavermodel er de fleste undersøgelser vaccination udføres med anvendelse af intravenøs immunisering, Som er den gyldne standard i form af beskyttende effekt. Imidlertid har beskrivelsen af en hud etape og betydningen af huden-associerede drænende lymfeknude (DLN) fremkalde beskyttelse ændret vores opfattelse af PE-fase og understregede betydningen af intradermal rute for injektion. Intravital billeddannelse af P. berghei sporozoiter injiceres i huden af gnavere har vist, at kun ca. 25% af podestoffet når leveren via blodbanen. De resterende ~ 75% fordeling mellem de proksimale DLN (~ 15%) og huden (~ 50%) 10,11, hvor en lille del kan transformere og forblive i live i uger inde hudceller 12,13. Desuden efterfølgende undersøgelser beskrevet, at etableringen af en effektiv beskyttende immunitet efter intradermal immunisering hovedsageligt foregår i huden-DLN, hvor parasit specifikke CD8 + T-celler aktiveres, og kun marginalt i milten eller leveren-DLN'er 14,15.
Mensde fleste undersøgelser har koncentreret sig om karakterisering af effektorcellerne impliceret i etableringen af beskyttende immunrespons, er langt mindre kendt om skæbne levende svækkede parasitter sprøjtes ind i huden, især deres interaktioner med det medfødte immunsystem. Især karakterisering af antigenpræsenterende celler involveret i parasitantigen optagelse, bearbejdning og præsentation for CD8 + -T-celler er af afgørende betydning, vel vidende at PE-antigen erhvervelse kan forekomme både i huden og DLN rum. Tidligere intravital billeddiagnostiske undersøgelser beskrevet en tidlig tilstrømning af lyst fluorescerende Lys-GFP-positive celler i huden efter en smitsom myggestik 16 mens tidlige interaktioner mellem sporozoiter og dendritiske celler blev observeret i DLN 10,17. For nylig er det blevet rapporteret, at sporozoiter inokuleret i huden af myg øger motiliteten af både dendritiske og regulatoriske T-celler i huden afmus, mens der blev observeret en nedgang antal antigenpræsenterende celler i DLN-18.
Vi havde til formål at identificere og kvantificere mere præcist leukocytundergrupper rekrutteret i huden og tilsvarende DLN såvel som dem interagere med parasitten efter intradermal injektion af immunisering doser af RAS 19. I denne sammenhæng har vi isoleret myeloide celler (CD45 + CD11 +) fra både væv og karakteriseret subpopulationer af interesse ved multi = parametrisk flowcytometri. I overensstemmelse med den immunreaktion, der er beskrevet i den tidlige fase af Leishmania major hudinfektion 20, den primære vært reaktion på sporozoit injektion består af en successiv rekruttering af polymorfonukleære neutrofiler (CD45 + CD11 + Ly6G + Ly6C int) efterfulgt af inflammatoriske monocytter (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +), som er identificeret på baggrund af differential udtryk for de Ly6G og Ly6C overflademarkører.
Vi beskriver her en protokol til isolering myeloide celler fra mus hud og DLN efter intradermal injektion af immunisering doser af RAS udvundet fra inficerede myg spytkirtler. Reproducerbare intradermale injektioner og vævsbehandling er kritiske skridt til at kvantificere fænotypiske ændringer i infiltrerende cellepopulation inden inficerede væv. Den fremgangsmåde er nærmere beskrevet nedenfor tilvejebringer en pålidelig analyse for at vurdere huden og DLN inflammatoriske respons på Plasmodium-parasitten og kan udvides til forskellige eksperimentelle systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I perspektivet af storstilet vaccination af mennesker ved hjælp af en hel sporozoit malariavaccine, en af de vigtigste udfordringer at overvinde, er at udvikle optimerede ruter og metoder parasit administration at sikre en vellykket immunisering og beskyttelse 24,25. Hos mennesker er blevet udført evaluering af beskyttende effekt medieret af levende svækkede parasitter (LAP) efter naturlig myggestik 2, samt intradermal, subkutan 25,26 og IV immuniseringer 27. Som rapportere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Patricia Baldacci, Vanessa Lagal og Sabine Thiberge for kritisk læsning, Irina Dobrescu og Sabine Thiberge om hjælp til at tage billeder og Pauline Formaglio til undervisning in vivo billeddannelse af sporozoit motilitet i musen huden. Vi vil også gerne takke Marek Szatanik og Center for Produktion og infektion af Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) for myg opdræt. Denne undersøgelse blev støttet af Research Fund AXA og midler fra Laboratoire d'Excellence "Integrativ Biology of Emerging Infectious Diseases" (give nr. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
