Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em> Plasmodium</em> sporozoiti
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Malaria inizia quando la fase sporozoite di Plasmodium è inoculata in pelle di un mammifero ospite attraverso una puntura di zanzara. Il parassita altamente mobili non raggiunge solo il fegato per invadere epatociti e la trasformazione in forma eritrociti-infettiva. Si migra anche nella pelle e per il linfonodo drenante prossimale sito di iniezione, dove può essere riconosciuto e degradato da residenti e / o di cellule mieloidi reclutate. L'imaging intravitale ha riferito l'assunzione precoce di fluorescenza brillante Lys-GFP leucociti positivi nella pelle e le interazioni tra sporozoiti e CD11c + cellule del linfonodo drenante. Presentiamo qui una procedura efficiente per recuperare, identificare e contare i sottoinsiemi di cellule mieloidi che vengono reclutati per la pelle del mouse e drenanti linfonodi dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di sporozoites in un modello murino. La caratterizzazione fenotipica usando flusso multi-parametrica fornisce citometriaun test affidabile per valutare i primi cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium.
Introduction
La malaria è una delle più letali malattie infettive in tutto il mondo, uccidendo più di mezzo milione di persone all'anno. Infezione da Plasmodium, l'agente causale della malattia, inizia una fase di pre-eritrocitaria (PE). Durante questa fase, sporozoiti iniettati nella pelle ospitante da una femmina anopheline zanzara raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno e si differenziano epatociti all'interno nelle forme parassiti che infettano i globuli rossi e causano i sintomi della malattia.
Le fasi PE di Plasmodium rappresentano un bersaglio privilegiato per la vaccinazione anti-malaria. In effetti, i vaccini vivi attenuati contro queste fasi, come la radiazione di attenuazione sporozoiti (RAS), parassiti geneticamente arrestati (GAP) o chemioprofilassi e sporozoiti (CPS) hanno dimostrato la loro capacità di proteggere sia roditori e ospiti umani 1-9. Nel modello di roditore, la maggior parte degli studi di vaccinazione sono condotti utilizzando l'immunizzazione per via endovenosa, Che è lo standard in termini di efficacia protettiva. Tuttavia, la descrizione di una fase pelle e l'importanza del linfonodo pelle associata drenante (DLN) nell'elicitazione protezione ha cambiato la nostra percezione della fase PE e sottolineato l'importanza della somministrazione intradermica di iniezione. L'imaging intravitale di P. sporozoiti berghei iniettati nella pelle dei roditori ha dimostrato che solo ~ 25% dell'inoculo raggiunge il fegato attraverso il flusso sanguigno. Il restante 75% ~ distribuisce tra prossimale DLN (~ 15%) e la pelle (~ 50%) 10,11, dove una piccola percentuale può trasformare e rimanere in vita per settimane all'interno delle cellule della pelle 12,13. Inoltre, studi successivi descrivono che l'istituzione di un'efficace immunità protettiva dopo la vaccinazione intradermica avviene principalmente nella pelle-DLN, in cui si attivano specifiche cellule parassita T CD8 +, e solo marginalmente nella milza o del fegato-dLNs 14,15.
Mentrela maggior parte degli studi si sono concentrati sulla caratterizzazione delle cellule effettrici implicati nella creazione di risposta immunitaria protettiva, e tanto meno si sa circa il destino dei parassiti vivi attenuati iniettati nella pelle, in particolare le loro interazioni con il sistema immunitario innato. In particolare, la caratterizzazione di cellule presentanti l'antigene coinvolti nella parassita antigene captazione, l'elaborazione e la presentazione di cellule T CD8 + è di importanza critica, sapendo che l'acquisizione di antigene PE può avvenire sia nella pelle e scomparti DLN. Precedenti studi di imaging intravitale descritto un afflusso iniziale di cellule positive fluorescenza brillante Lys-GFP nella pelle in seguito ad un morso di zanzara infettiva 16 mentre i primi interazioni tra sporozoiti e cellule dendritiche sono stati osservati nel DLN 10,17. Più recentemente, è stato riportato che sporozoiti inoculati nella pelle dalle zanzare aumenta la motilità sia delle cellule T dendritiche e regolamentari nella pelletopi, mentre è stata osservata una serie diminuzione di cellule presentanti l'antigene nel DLN 18.
Si è voluto identificare e quantificare più precisamente i sottoinsiemi di leucociti reclutati nella pelle e corrispondenti DLN nonché coloro che interagiscono con il parassita dopo iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS 19. In questo contesto, abbiamo isolato le cellule mieloidi (CD45 + CD11b +) da entrambi i tessuti e caratterizzato sottopopolazioni di interesse da parte di più = flusso parametrico citometria. Coerentemente con la risposta immunitaria descritto nella fase iniziale della Leishmania importante infezione della pelle 20, la risposta dell'ospite principale per sporozoite iniezione è costituito da una assunzione successiva di neutrofili polimorfonucleati (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguita da monociti infiammatorie (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) che sono identificate in base ad DifferentiAl espressione dei marcatori di superficie Ly6G e Ly6C.
Descriviamo qui un protocollo per isolare cellule mieloidi dalla pelle del mouse e DLN dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS estratti da infetti ghiandole salivari delle zanzare. iniezioni intradermiche riproducibili e lavorazione dei tessuti sono passi fondamentali per quantificare i cambiamenti fenotipici di infiltrazione popolazione di cellule all'interno dei tessuti infetti. L'approccio seguito dettagliato fornisce un test affidabile per valutare la pelle e la risposta infiammatoria DLN al Plasmodium parassita e può essere esteso a vari sistemi sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella prospettiva della vaccinazione su larga scala degli esseri umani utilizzando un intero vaccino contro la malaria sporozoite, una delle principali sfide da superare è quello di sviluppare percorsi e metodi di somministrazione parassita ottimizzati per garantire l'immunizzazione e la protezione 24,25 successo. Negli esseri umani, la valutazione della efficacia protettiva mediata da parassiti vivi attenuati (LAP) sono seguite zanzara naturale morde 2, nonché intradermica, sottocutanea <sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge per la lettura critica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge aiuto per scattare foto e Pauline Formaglio per l'insegnamento imaging in vivo di sporozoite motilità nella pelle del mouse. Vorremmo anche ringraziare Marek Szatanik e il Centro di Produzione e infezione di Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) per l'allevamento di zanzare. Questo studio è stato sostenuto dal Fondo AXA Ricerca e fondi dal Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa di Emerging Infectious Diseases" (Grant no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
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