I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1
Summary
Con il murino ABC trasportatore Bcrp1 (ABCG2), come esempio, in-silico protocolli sono presentati per rilevare utilizzo promotore alternativo geni espressi in tessuti di topo, e per valutare la funzionalità dei promotori alternativi identificati mediante saggi del reporter.
Abstract
L'espressione genica in diversi tessuti è spesso controllata da promotori alternativi che risultano nella sintesi di mRNA con uniche – di solito non tradotte – primi esoni. Bcrp1 (ABCG2), il ortologo murino della ABC trasportatore Breast Cancer Resistenza Protein (BCRP, ABCG2), ha almeno quattro promotori alternativi che sono designati dai corrispondenti quattro primi esoni alternativi prodotte: E1U, E1A, E1B, e E1C. Qui, in-silico protocolli vengono presentati per prevedere l'utilizzo promotore alternativa per Bcrp1. Inoltre, metodi di analisi giornalista sono descritti per produrre costrutti reporter per promotori alternativi e per determinare la funzionalità dei promotori putativi monte dei primi esoni alternativi identificati.
Introduction
Più della metà dei geni umani sono regolati dai promotori alternativi 1. Ogni promotore alternativa può contenere elementi regolatori che possono essere diverse da quelle degli altri promotori alternativi. Il promotore (s) utilizzato in un tessuto può differire da quelli utilizzati in un altro tessuto. Ad esempio, è possibile che l'attivazione di un dato percorso di segnalazione può attivare il promotore alternativa a un gene utilizzata in un tessuto, ma non hanno alcun effetto o reprimere un promotore alternativa separato per lo stesso gene che viene utilizzata in un altro tessuto.
L'espressione del gene Bcrp1 è governato da promotori alternativi. Bcrp1 è il ortologo murino del gene materno Resistenza Cancer Protein (BCRP). BCRP è un trasportatore di ATP-binding cassette (ABC), ABCG2 2, 3 formalmente designato. Come una proteina di membrana apicale, BCRP funzioni / Bcrp1 di efflusso una vasta gamma di substrati naturali e xenobiotici <sup> 3, 4. Negli esseri umani e topi, BCRP / Bcrp1 è altamente espresso negli organi farmacologicamente rilevanti come fegato (canalicoli biliari), intestino e reni, nonché organi con barriere sangue-tessuto come placenta, cervello e testicoli 2, 5 – 12. L'espressione di BCRP / Bcrp1 in ematopoietiche e di altre cellule staminali, comprese le cellule staminali del cancro, può conferire resistenza di queste cellule di xenobiotici e cancro farmaci chemioterapici 3.
Nel lavoro presto per capire la regolazione dell'espressione BCRP in cellule normali e neoplastiche, 5 'rapida amplificazione del cDNA estremità (5'-RACE) analisi di BCRP mRNA è stata eseguita per determinare il suo sito di inizio della trascrizione esatta 13. Non solo erano più siti di inizio della trascrizione trovati; anche incontrato erano tre forme alternative di primo esone, che a sua BCRP è tradotto. Queste alternative primi esoni – designati E1a, E1b, E1c – sono stati espressi in modo diverso in una varietà di tessuti umani. Due ulteriori varianti primo esone sono stati scoperti in una ricerca BLAST del database EST umana utilizzando il secondo esone del BCRP 13. Quattro partite rivelato un primo esone> 70 kb a monte dell'esone 2 che sono stati designati E1U; altre quattro partite hanno rivelato BCRP mRNA che mancava di un primo esone del tutto, che sono stati designati E1 13. La presenza di esoni capo alternativi è considerato una manifestazione di utilizzo promotore alternativa 14.
Nei topi, quattro alternative primi esoni di Bcrp1 sono descritte che può corrispondere ai promotori alternativi che governano BCRP 1 trascrizione in diversi tessuti di topo; questi esoni / promotori sono designati E1U, E1A, E1B e E1C, e si trovano a circa 70, 58, 15, e 5 kb a monte Bcrp1 esone 2 5, 15. L'isoforma E1A mRNA è risultata predominante in MurinLe cellule staminali ematopoietiche e, cuore, polmone, milza e cervello, mentre l'isoforma E1B è stata espressa in nell'intestino del mouse, le cellule del fegato fetale, e precursori eritroidi nel midollo osseo 5, 15. Il promotore a monte E1B ha dimostrato di essere il principale promotore di alternativa di governo Bcrp1 trascrizione nell'intestino del mouse, regolato almeno in parte, da fosfo-ciclico-AMP risposta elemento binding protein (p-CREB) e un elemento di risposta CREB unico per quella alternativa promotore Bcrp1 16. L'isoforma E1C mRNA è prevalentemente espresso nel fegato murino adulti e reni 5. L'isoforma E1U è rilevabile nella maggior parte dei tessuti esaminati eccetto testicolo murino, dove è l'isoforma predominante espresso 5. Bcrp1 espresso in testicoli di ratto si trova in entrambe le somatiche (giunzioni strette endoteliali, cellule myoid peritubulari, e cellule di Sertoli) e le cellule germinali (nel endotelio seminifero, dove si può proteggere spermatidi fase tardo-4). il region monte E1U contiene un elemento di risposta funzionale per steroidea factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA e di proteine sono marcatamente ridotti nei testicoli di topi knockout Sertoli cellule specifiche SF-1, suggerendo che l'espressione Bcrp1 in cellule di Sertoli murine è controllato da SF-1 5.
I protocolli presentati metodi dettaglio per rilevare alternative primi esoni del Bcrp1 in-silico, e di stabilire saggi luciferasi-based per i promotori putativi monte dalle prime esoni alternativi individuati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La maggior parte dei metodi e dei risultati rappresentativi presentati sono descritti nel precedente lavoro intitolato "B crp1 trascrizione nei testicoli del mouse è controllato da un promotore a monte di un romanzo primo esone (E1U) regolato da steroidea fattore-1", che è stato pubblicato nel 2013 5 . Oltre ai risultati rappresentativi raffigurati, la carta precedente fornito stime delle alternative prima utilizzazione esone usando 5'-RACE metodologia PCR e RT-PCR. Inoltre, in-si…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da Merit Review Awards per Douglas D. Ross e per Arif Hussain dal Department of Veterans Affairs.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
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