Yöntemler Fare Bcrp1 Alternatif Promoter Kullanımı ve Transkripsiyonal Yönetmeliği Discover
Summary
Örneğin, kemirgen ABC transportörlerin Bcrp1 (Abcg2) ile, in-siliko protokolleri fare dokularda eksprese edilen genlerin alternatif promoter kullanımı tespit etmek için, ve raportör tahlilleri kullanılarak belirlenen alternatif promoterlerin özelliğe değerlendirmek için sunulmaktadır.
Abstract
Genellikle çevrilmemiş – – birinci ekson, farklı dokularda gen ekspresyon genellikle özgü mRNA'nın sentezinde neden alternatif promotörler tarafından kontrol edilir. E1U, E1A, E1B ve E1C: Bcrp1 (Abcg2), ABC taşıyıcı Meme Kanseri direnç proteini (BCRP, ABCG2) murin ortolog üretilen karşılık gelen dört alternatif ilk ekson tarafından belirlenmiş olan en az dört alternatif promotörler vardır. Burada, içi siliko protokolleri Bcrp1 alternatif promoter kullanımı tahmin etmek için sunulmuştur. Ayrıca, haberci deneyi yöntemleri alternatif promotörleri için haberci yapıları üretmek ve yukan tanımlanan alternatif ilk eksondan putatif promoterlerin özelliğe belirlemek için tarif edilmiştir.
Introduction
Daha insan genlerinin yarısı alternatif rehberleri 1 düzenlenir. Her alternatif promotör alternatif rehberleri bu farklı olabilir düzenleyici unsurları içerebilir. bir doku kullanılan hızlandırıcı (lar) başka bir doku kullanılanlardan farklı olabilir. Örneğin, belirli bir sinyal yolunun aktivasyonu bir dokuda kullanılan bir genin alternatif promoter tetikler, ancak hiçbir etkisi yoktur veya başka bir dokuya kullanılan aynı geni için, ayrı bir alternatif promoter bastırmak mümkündür.
Bcrp1 geninin ekspresyonu, alternatif promotörler tarafından yönetilir. Bcrp1 insan göğüs kanseri direnç proteini (BCRP) genin fare ortolog olan. BCRP ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı, resmi olarak belirlenen ABCG2 2, 3. bir tepe plazma zar proteini olarak, BCRP / Bcrp1 fonksiyonları doğal ve ksenobiyotik alt tabakalar çeşitli akıttığı <sup> 3, 4. 12 – İnsan ve farelerde, BCRP / Bcrp1 yüksek örneğin plasenta, beyin ve testis 2, 5 kan doku bariyerleri karaciğer (safra kanalcıklarının), bağırsak ve böbrek gibi organların farmakolojik olarak ilgili organlar olarak ifade edilir. Hematopoietik ve kanser kök hücreleri dahil olmak üzere diğer kök hücreler, içinde BCRP / Bcrp1 ifadesi ksenobiyotiklere ve kanser kemoterapötik ilaçları 3, bu hücrelerin direnci kazandırabilmektedir.
Normal ve neoplastik hücrelerde BCRP ekspresyonunun düzenlenmesi anlamak için ilk çalışmada, cDNA uçlarının (5'-RACE) BCRP mRNA analizi 5 'hızlı amplifikasyonu onun tam transkripsiyon başlangıç bölgesinin 13 belirlemek için yapıldı. Sadece bulundu birden transkripsiyon başlangıç siteleri vardı; Ayrıca BCRP de çevrilmemiş ilk ekson, üç alternatif formları vardı karşılaştı. Bu alternatif, ilk ekson – E1 belirlenen, E1B, E1C – insan dokularının çeşitli farklı ifade edildi. İki ek birinci ekson varyantları BCRP 13 ikinci ekson kullanılarak insan EST veritabanının bir BLAST arama keşfedildi. Dört maç yukarı E1u belirlenmiştir ekson 2 birinci ekson> 70 kb ortaya; diğer dört maç E1- 13 belirlenmiştir tamamen ilk ekson yoksun BCRP mRNA, ortaya çıkardı. Alternatif lider ekzon varlığı alternatif promotör kullanımı 14 bir tezahürü olarak kabul edilir.
Farelerde, Bcrp1 dört alternatif ilk ekson farklı fare dokularda BCRP 1 transkripsiyonu yöneten alternatif rehberleri karşılık gelebilir o tarif edilmektedir; Bu ekzon / promoterler E1U, E1A, E1B ve E1C belirlenir ve yaklaşık olarak konumlanmış 70, Bcrp1 ekson 2 5, 15 ile üst baş 58, 15 ve 5 kb. E1A mRNA izoform murin baskın olduğu bulunmuşturE hematopoietik kök hücreler, kalp, akciğer, dalak ve beyin, E1B izoformu kemik iliği 5, 15 fare bağırsak, cenin karaciğer hücreleri ve eritrosit öncü hücrelerin ifade görülebilecektir. yukan E1B hızlandırıcıdır fosfo-siklik-AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein (p-CREB) ve alternatif özgü bir CREB tepki elemanı, en azından kısmen regüle fare bağırsak Bcrp1 transkripsiyonu düzenleyen önemli bir alternatif promoter olduğu gösterilmiştir Bcrp1 destekleyicisi 16. E1C mRNA isoformudur Yetişkin fare karaciğer ve böbrek 5 olarak ifade edilir. E1U izoformu da 5 ifade baskın izoformdur murin testis haricinde test edilen pek çok dokuda tespit edilemez. Bcrp1 (geç evre spermatid 4 koruyabilir seminifer endotel olarak) hem somatik (endotel sıkı kavşaklar, peritübüler Miyoid hücreleri ve Sertoli hücrelerinde) ve germ hücreleri bulunan sıçan testis olarak ifade edilmiştir. regyukan E1U iyon steroidojenik faktörü-1 (SF-1) 5 için işlevsel bir tepki elemanı içerir. Bcrp1 mRNA ve protein belirgin sıçangil Sertoli hücrelerinde Bcrp1 sentezleme SF-1 5 tarafından kontrol edildiğini düşündüren, Sertoli hücreye spesifik SF-1 nakavt fareler testislerde azaltılır.
Detay yöntemleri sunulan protokoller de-silisyum Bcrp1 alternatif ilk ekson tespit etmek ve yukarı tespit alternatif ilk ekzon gelen varsayılan proje sahipleri için lusiferaz tabanlı muhabiri deneyleri kurmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntem ve Örnek sonuçların çoğu, 2013 5 yayımlanan "fare testis B crp1 transkripsiyon yukan steroidojenik faktör-1 ile düzenlenir, yeni bir birinci ekson (E1U) 'in bir promoter tarafından kontrol edilir" başlıklı daha önceki çalışmaları tarif edilmektedir . burada gösterilen Örnek sonuçlarına ek olarak, önceki kağıt 5'-RACE PCR ve RT-PCR yöntemi kullanılarak, alternatif birinci ekson kullanımı tahmin sağladı. Bundan başka, in siliko y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Douglas D. Ross ve Gazi İşleri Bölümü'nden Arif Hussain Merit İnceleme Awards tarafından desteklenmiştir.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
