Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Met de komst van de -omics zal ons begrip van de chronische ziekten zoals kanker en metabool syndroom is verbeterd. Echter, effectieve winning van de informatie in de grootschalige datasets die worden verkregen van genexpressie microarrays, deep sequencing experimenten of metabool profiel is van essentieel belang om te ontdekken en vervolgens gerichter de kritische regulatoren van zieke cel fenotypes. Oestrogeen Receptor α (ERa) is een van de master transcriptiefactoren reguleren van het gen programma's die belangrijk zijn voor oestrogeen reagerende borstkanker zijn. Om te begrijpen om de rol van ERa signalering bij borstkanker metabolisme benut we transcriptomische, cistromic en metabolomic gegevens van MCF-7 cellen behandeld met estradiol. In dit rapport beschreven we generatie van monsters voor RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics experimenten en de integratieve computationele analyse van de verkregen gegevens. Deze benadering is nuttig bij het afbakenen nieuwe molname op mechanismen en genregulerend circuits die worden geregeld door een bepaalde transcriptiefactor die gevolgen metabolisme van normale of zieke cellen.
Oestrogenen zijn belangrijke regulatoren van vele fysiologische processen bij zowel vrouwen als mannen, waaronder reproductieve weefsels, metabole weefsels, de hersenen en bot 1. Naast gunstige effecten in deze weefsels, oestrogenen ook kankers die ontstaan uit borstklier en reproductieve weefsels rijden. Oestrogenen voornamelijk werken via ERS om celtype specifieke effecten veroorzaken. Deep sequencing van transcripten gereguleerd door ERa behulp van RNA-Seq en genoom-brede ERa DNA bindingsplaatsen analyse met behulp van ChIP-Seq bleek nuttig te zijn om te begrijpen hoe ERa werkt in verschillende weefsels en kankers die ontstaan uit hen. Wij en anderen hebben genexpressieprofielen in verband met verschillende receptoren (ERa vs ERP) 2,3, verschillende liganden 3-5 en verschillende Coregulatoren 2,4,6,7 gepubliceerd.
RNA-Seq is de belangrijkste methode om de transcriptoom onderzoeken met hogere precisie en efficiëntie ten opzichte van microarray based genexpressie analyse 8. RNA verkregen uit cellijnen 2-4,7, weefsels of tumor monsters worden gesequenced, toegewezen aan beschikbare genomische vergaderingen en differentieel gereguleerde genen geïdentificeerd. Chromatine Immunoprecipitatie (chip) wordt gebruikt om de transcriptiefactor en coregulator chromatine binding aan bekende regelgeving bindingsplaatsen ontleden. ChIP-Seq (chip, gevolgd door high throughput sequencing) biedt detectie van de wereldwijde binding sites. Metabolomics is nog steeds gebruikte systeembiologie aanpak, die kwantitatief maatregelen, dynamische Multiparametrische respons van levende systemen op verschillende stimuli, waaronder chemicaliën en genetische storingen.
Door het uitvoeren van globale metabool profilering kan een functionele aflezing worden verkregen uit cellen, weefsels en bloed. Daarnaast hebben informatie van transcriptoom experimenten niet altijd overeen met de werkelijke veranderingen in het niveau van enzymen die bijdragen aan de biochemische pathways. gecombineerdeanalyse van transcriptoom en metaboloom gegevens kunnen wij identificeren en correleren veranderingen in genexpressie met werkelijke veranderingen metaboliet. Benutten van de informatie uit deze grootschalige datasets over een mechanistische informatie om de rol van transcriptiefactoren reguleren van complexe biologische systemen, met name degenen die betrekking hebben op menselijke ontwikkeling en ziekten zoals kanker en diabetes begrijpen.
De complexe aard van het zoogdier genoom maakt het een uitdaging om te integreren en volledig de resultaten van het transcriptoom, cistrome en metaboloom experimenten gegevens te interpreteren. Identificatie van functionele bindende gebeurtenissen die zouden leiden tot veranderingen in de expressie van genen doelgroep is belangrijk, want zodra functionele bindingsplaatsen worden geïdentificeerd; daaropvolgende analyse, waaronder transcriptie binding (TF) motief analyse kan worden uitgevoerd met hogere nauwkeurigheid. Dit leidt tot de identificatie van biologisch betekenisvolle TF cascades en mechanismen. Ook directe comparisop RNA-Seq en ChIP-Seq experimenten niet altijd mogelijk omdat de data van elk experiment zijn verschillende schalen en geluiden en soms betekenisvolle signalen worden verhuld door ruis bevolking. We zijn niet bewust van enige studie die informatie uit deze drie onafhankelijke maar verwante benaderingen van het directe metabole regulatie van ERa bij borstkanker begrijpen geïntegreerd. Daarom is onze algemene doelstelling in dit document is te relateren productieve binding evenementen om genexpressie en metaboliet verandert. Om dit doel te bereiken, we geïntegreerd gegevens van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics experimenten en geïdentificeerd die oestrogeen geïnduceerde ERa bindend gebeurtenissen die zouden leiden tot genexpressie veranderingen in de metabole routes. Voor de eerste keer, bieden we een complete set van protocollen (figuur 1) voor het genereren van ChIP-Seq, RNA-Seq en metabolomics profilering en het uitvoeren van integratieve analyse van de gegevens aan nieuwe gen circuits reguleren van het metabolisme van de borst bloot te leggenkanker cellijnen.
In dit artikel beschrijven we genereren en integratieve analyse van RNA-Seq, ChIP-Seq en metabolomics gegevens van MCF-7-cellen die zijn behandeld met E2. We ontwikkelden een reeks protocollen strategizing om de meest efficiënte methoden en gebruiksvriendelijke zachte waren die biologisch relevante ontdekking te produceren gebruiken. Voor zover wij weten, onze is de eerste studie om -omics data integreren uit drie verschillende analyses en geïdentificeerd nieuwe metabole routes die ERa direct gereguleerd in borstkanke…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw, US Department of Agriculture, award ILLU-698-909 (ZME) en Pfizer, Inc (ZME). De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van het Amerikaanse ministerie van Landbouw.
Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
DNTP MIX | NEB | N0447S | |
M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |