علم الأحياء نظم تنظيم التمثيل الغذائي عن طريق مستقبلات الاستروجين في اشارة الى سرطان الثدي
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
مع قدوم -omics النهج فهمنا للأمراض المزمنة مثل السرطان ومتلازمة التمثيل الغذائي قد تحسن. ومع ذلك، التعدين الفعال للمعلومات في قواعد البيانات واسعة النطاق التي يتم الحصول عليها من ميكروأرس التعبير الجيني، والتجارب تسلسل عميقة أو التنميط التمثيل الغذائي أمر ضروري لكشف ومن ثم تستهدف على نحو فعال المنظمين تنتقد الظواهر الخلايا المريضة. مستقبلات الاستروجين α (ERα) هي واحدة من عوامل النسخ سيد تنظيم برامج الجينات التي تعتبر مهمة لهرمون الاستروجين سرطان الثدي استجابة. من أجل فهم لدور ERα يشير في التمثيل الغذائي سرطان الثدي نحن تستخدم البيانات transcriptomic، cistromic وmetabolomic من MCF-7 الخلايا تعامل مع استراديول. في هذا التقرير وصفنا جيل من العينات لRNA تسلسل، رقاقة تسلسل والتجارب الايض والتحليل الحسابي التكاملي للبيانات التي تم الحصول عليها. هذه الطريقة مفيدة في تحديد الخلد روايةآليات دائرية ودوائر الجينات التنظيمية التي تنظم من قبل عامل النسخ معين مما يؤثر التمثيل الغذائي للخلايا العادية أو المريضة.
Introduction
هرمون الاستروجين هي منظمات هامة لكثير من العمليات الفسيولوجية في كل من الإناث والذكور بما في ذلك الأنسجة التناسلية، الأنسجة التمثيل الغذائي والدماغ والعظام 1. بالإضافة إلى آثار مفيدة في هذه الأنسجة، هرمون الاستروجين أيضا دفع السرطانات التي تنشأ من الثدي والأنسجة التناسلية. هرمون الاستروجين يعمل أساسا من خلال المتطلبات البيئية للحث على نوع من الخلايا آثار محددة. أثبت تسلسل عميق من النصوص التي تنظمها ERα باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وعلى نطاق الجينوم ERα تحليل الحمض النووي مواقع الربط باستخدام رقاقة تسلسل لتكون مفيدة لفهم كيفية عمل ERα في الأنسجة وأمراض السرطان المختلفة التي تنجم عنها. نحن وغيرنا قد نشرت الجينات ملامح التعبير يرتبط مع مستقبلات مختلفة (ERα مقابل ERβ) 2،3، بروابط مختلفة 3-5 وcoregulators مختلفة 2،4،6،7.
RNA تسلسل هو الأسلوب الرئيسي لدراسة Transcriptome على، وتقديم أعلى دقة وكفاءة مقارنة با ميكروأريتحليل التعبير الجيني (سيد) 8. وتسلسل الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا 2-4،7 أو الأنسجة أو عينات الورم، وتعيينها إلى المجالس الجينومية المتاحة ويتم تحديد الجينات ينظم بشكل مختلف. ويعمل لونين مناعي (رقاقة) لتشريح عامل النسخ وcoregulator الكروماتين ملزمة لمواقع الربط التنظيمية المعروفة. رقاقة تسلسل (رقاقة تليها عالية التسلسل الإنتاجية) على الكشف غير متحيز للمواقع الربط العالمية. الايض هو نهج آخر تستخدم بشكل متزايد البيولوجيا النظام الذي كميا التدابير، استجابة multiparametric ديناميكية من الأنظمة الحية لمختلف المنبهات بما في ذلك المواد الكيميائية والاضطرابات الوراثية.
عن طريق أداء التنميط التمثيل الغذائي العالمي، ويمكن الحصول على قراءات وظيفية من الخلايا والأنسجة والدم. وبالإضافة إلى ذلك، معلومات من تجارب Transcriptome على لا تعكس دائما التغيرات الفعلية في مستوى الانزيمات التي تساهم في المسارات البيوكيميائية. الجمع بينتحليل البيانات Transcriptome على وmetabolome تمكننا من تحديد وربط التغيرات في التعبير الجيني مع التغييرات الأيض الفعلية. تسخير المعلومات من جميع وتوفر هذه المجموعات على نطاق واسع في تفاصيل الآلية لفهم دور عوامل النسخ التي تنظم النظم البيولوجية المعقدة، وخاصة تلك التي تتعلق بالتنمية البشرية والأمراض مثل السرطان والسكري.
الطبيعة المعقدة للجينوم الثدييات يجعل صعوبة في الاندماج وتفسير البيانات التي تم الحصول عليها من Transcriptome على، cistrome وmetabolome التجارب بشكل كامل. تحديد الأحداث ملزمة الوظيفية التي من شأنها أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير عن الجينات المستهدفة مهم جدا لأنه يتم تحديد مواقع الربط مرة واحدة الوظيفية؛ تلت ذلك التحليل، بما في ذلك النسخ ملزمة (TF) تحليل عزر، يمكن أن يؤديها مع أعلى قدر من الدقة. وهذا يؤدي إلى التعرف على شلالات TF ذات مغزى من الناحية البيولوجية والآليات. comparis المباشرة أيضاعلى التجارب يليها-RNA والشذرة يليها ليست دائما ممكنة لأن البيانات من كل تجربة لها اختلاف المقاييس والضوضاء، وفي بعض الحالات يتم حجب إشارات ذات مغزى من الضوضاء السكان. نحن لسنا على علم بأي دراسة تلك المعلومات من هذه المناهج مستقلة ولكنها ذات صلة ثلاث لفهم تنظيم التمثيل الغذائي المباشر من قبل ERα في سرطان الثدي المتكاملة. لذلك، لدينا الهدف العام في هذه الورقة هو لربط الأحداث ملزمة الإنتاجية إلى التعبير الجيني والتغيرات الأيض. من أجل تحقيق هذا الهدف، ونحن دمج بيانات من RNA تسلسل، رقاقة تسلسل والايض التجارب وتحديد تلك التي يسببها هرمون الاستروجين ERα الأحداث التي من شأنها أن تؤدي إلى تغيرات التعبير الجيني في المسارات الأيضية ملزمة. للمرة الأولى، ونحن نقدم مجموعة كاملة من البروتوكولات (الشكل 1) لتوليد رقاقة تسلسل، RNA تسلسل والايض التنميط وإجراء تحليل متكامل من البيانات للكشف عن الدوائر الجينات الجديدة التي تنظم عملية التمثيل الغذائي للالثديخطوط الخلايا السرطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، وصفنا جيل والتحليل التكاملي من الحمض النووي الريبي تسلسل، رقاقة تسلسل والبيانات الايض من MCF-7 الخلايا التي يتم التعامل مع E2. قمنا بتطوير مجموعة من بروتوكولات وضع استراتيجيات للاستفادة من الأساليب الأكثر فعالية وسهولة التركيبات الناعمة الودية التي تنت…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للأغذية والزراعة، وزارة الزراعة، جائزة ILLU-698-909 (ZME) وفايزر، وشركة (ZME). محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية لوزارة الزراعة الأمريكية.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
- Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
- Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
- Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
- Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
- Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).
