Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Med fremkomsten af de -omik nærmer vores forståelse af de kroniske sygdomme som kræft og metabolisk syndrom er forbedret. Men effektiv udvinding af oplysningerne i de store datasæt, der er fremstillet af genekspression microarrays, dybe sekventering eksperimenter eller metabolisk profilering er afgørende for at afdække og derefter effektivt målrette de kritiske regulatorer af syge celle fænotyper. Østrogen-receptor α (ERa) er en af de store transkriptionsfaktorer der regulerer genprogrammer der er vigtige for østrogen-responsive brystkræft. For at forstå at rolle ERa signalering i brystkræft metabolisme udnyttede vi transkriptom, cistromic og metabolomisk data fra MCF-7-celler behandlet med østradiol. I denne rapport beskrev vi generation af prøver til RNA-Seq, chip-Seq og metabolomik eksperimenter og integrativ beregningsmæssige analyse af de opnåede data. Denne fremgangsmåde er nyttig til afgrænsning hidtil ukendte molCULAR mekanismer og gen-regulerende kredsløb, der er reguleret af en bestemt transskription faktor, som påvirker metabolisme af normale eller syge celler.
Østrogener er vigtige regulatorer af mange fysiologiske processer i både kvinder og mænd, herunder reproduktive væv, metaboliske væv, hjerne og knogler 1. Ud over gavnlige virkninger i disse væv, østrogener også køre kræft, der opstår fra brystkirtler og reproduktive væv. Østrogener hovedsageligt arbejde gennem ER'er at fremkalde celle typespecifikke effekter. Deep sekventering af udskrifter reguleret af ERa hjælp RNA-Seq og genom-dækkende ERa DNA bindingssteder analyse ved hjælp chip-Seq vist sig at være nyttigt at forstå, hvordan ERa arbejder i forskellige væv og kræft, der opstår fra dem. Vi og andre har publiceret genekspression profiler forbundet med forskellige receptorer (ERa vs ERP) 2,3, forskellige ligander 3-5 og forskellige coregulators 2,4,6,7.
RNA-Seq er den vigtigste metode til at undersøge transkriptomet, der tilbyder større præcision og effektivitet i forhold til microarray based genekspression analyse 8. RNA opnået fra cellelinjer 2-4,7, væv eller tumor prøver sekventeret, mappes til rådighed genomiske forsamlinger og varierende regulerede gener identificeres. Kromatin Immunpræcipitation (chip) er ansat til at dissekere transskription faktor og coregulator kromatin binding til kendte regulatoriske bindingssteder. Chip-Seq (chip efterfulgt af high throughput sekventering) giver uvildig påvisning af globale bindingssteder. Metabolomics er en anden mere og mere anvendt system biologi tilgang, som kvantitativt foranstaltninger, dynamisk multiparametric respons levende systemer på forskellige stimuli, herunder kemikalier og genetiske forstyrrelser.
Ved at udføre global metabolisk profilering, kan en funktionel udlæsning opnås fra celler, væv og blod. Hertil kommer, at oplysninger fra transkriptom eksperimenter ikke altid afspejler de faktiske ændringer i niveauet af enzymer, der bidrager til biokemiske veje. Kombineretanalyse af transkriptom og metabolomet data gør det muligt at identificere og korrelere ændringer i genekspression med faktiske metabolit ændringer. Udnyttelse af oplysninger fra alle disse store skala datasæt give mekanistiske detaljer for at forstå betydningen af transkriptionsfaktorer, der regulerer komplekse biologiske systemer, især dem, der vedrører menneskelig udvikling og sygdomme som kræft og diabetes.
Den komplekse karakter af pattedyrs genom gør det udfordrende at integrere og fuldt fortolke data fra transkriptom, cistrome og metabolomet eksperimenter. Identifikation funktionelle bindende begivenheder, der ville føre til ændringer i ekspression af målgener er vigtig, fordi når funktionelle bindingssteder er identificeret; efterfølgende analyse, herunder transkription binding (TF) motiv analyse kunne udføres med større nøjagtighed. Dette fører til identifikationen af biologisk meningsfulde TF kaskader og mekanismer. Også direkte comparispå af RNA-Seq og chip-Seq eksperimenter er ikke altid muligt, da dataene fra hvert eksperiment har forskellige skalaer og lyde og i nogle tilfælde meningsfulde signaler tilsløret af befolkningen støj. Vi er ikke bekendt med nogen undersøgelse, der integrerede oplysninger fra disse tre uafhængige, men beslægtede tilgange til at forstå den direkte metabolisk regulering af ERa i brystkræft. Derfor er vores overordnede mål i dette papir er at relatere produktive bindende begivenheder til genekspression og metabolit ændringer. For at nå dette mål, integrerede vi data fra RNA-Seq, CHIP-Seq og metabolomik eksperimenter og identificerede dem østrogen induceret ERa bindende begivenheder, der ville føre til genekspression ændringer i metaboliske veje. For første gang, giver vi et komplet sæt af protokoller (figur 1) til at generere chip-Seq, RNA-Seq og metabolomics profilering og udføre integrativ analyse af data for at afdække nye gen kredsløb regulerer stofskiftet af brystkræftcancercellelinjer.
I dette papir, beskrev vi generering og integrativ analyse af RNA-Seq, chip-Seq og metabolomics data fra MCF-7-celler, der er behandlet med E2. Vi udviklede et sæt protokoller Strategizing at udnytte de mest effektive metoder og brugervenlige bløde varer, som producerer biologisk relevant opdagelse. Til vores viden, vores er den første undersøgelse til at integrere genomenbaserede data fra tre forskellige analyser og identificerede nye metaboliske veje, som ERa direkte reguleret i brystkræftceller.
<p class="jo…The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det nationale institut for fødevarer og landbrug, US Department of Agriculture, tildeling Illu-698-909 (ZME) og Pfizer, Inc. (ZME). Dens indhold er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle udsigt over amerikanske landbrugsministerium.
Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
DNTP MIX | NEB | N0447S | |
M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |