Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
Mit dem Aufkommen der -omics nähert sich unser Verständnis der chronischen Krankheiten wie Krebs und metabolische Syndrom hat sich verbessert. Allerdings effektive Abbau von den Informationen in den großen Datenmengen, die von Genexpression Microarrays, deep sequencing Experimente oder metabolischen Profils erhalten werden ist wichtig, zu entdecken und dann effektiv die kritischen Regulatoren der erkrankten Zelle Phänotypen Ziel. Estrogen Receptor α (ERa) ist einer der Master-Transkriptionsfaktoren, die Gen-Programme regulieren, die für Östrogen-responsiven Brustkrebs wichtig sind. Um Rolle von ERa Signalisierung bei Brustkrebs Stoffwechsel zu verstehen, verwendeten wir transkriptomischen, cistromic und Metabolom-Daten aus MCF-7 mit Östradiol behandelten Zellen. In diesem Bericht beschrieben wir Generation von Proben für die RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und die integrative Computeranalyse der erhaltenen Daten. Dieser Ansatz ist nützlich bei der Abgrenzung Roman Maulwurfdere Mechanismen und genregulatorischen Schaltungen, die durch einen bestimmten Transkriptionsfaktor, der Auswirkungen auf den Stoffwechsel von normalen oder erkrankten Zellen reguliert werden.
Introduction
Östrogene sind wichtige Regulatoren von vielen physiologischen Prozessen in beiden Frauen und Männern einschließlich der reproduktiven Gewebe, metabolischen Gewebe, Gehirn und Knochen 1. Neben positiven Auswirkungen in diesen Geweben, treiben Östrogene auch Krebserkrankungen, die aus Brust und reproduktive Gewebe entstehen. Östrogene vor allem durch ERs arbeiten zelltypspezifische Effekte zu induzieren. Tief Sequenzierung von Transkripten von ERa geregelt unter Verwendung von RNA-Seq und genomweite ERa DNA-Bindungsstellen-Analyse ChIP-Seq Verwendung erwies sich als nützlich, um zu verstehen, wie ERa in verschiedenen Geweben und Krebsarten arbeitet, die aus ihnen entstehen. Wir und andere haben Profile veröffentlicht Genexpression assoziiert mit verschiedenen Rezeptoren (ER & agr; vs ER & bgr;) 2,3, verschiedene Liganden 3-5 und verschiedene Koregulatoren 2,4,6,7.
RNA-Seq ist die wichtigste Methode, um die Transkriptom zu untersuchen, bietet eine höhere Präzision und Effizienz im Vergleich zu Microarray-based Genexpressionsanalyse 8. RNA , die aus Zelllinien 2-4,7, Geweben oder Tumorproben werden sequenziert, abgebildet erhältlich genomischen Baugruppen und unterschiedlich regulierte Gene identifiziert werden. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) verwendet, um den Transkriptionsfaktor und coregulator Chromatin Bindung an bekannten regulatorischen Bindungsstellen zu sezieren. ChIP-Seq (ChIP durch hohe Durchsatzsequenzierung gefolgt) bietet unvoreingenommene Erfassung des globalen Bindungsstellen. Metabolomics ist ein weiterer zunehmend verbreitetes System biologischen Ansatz, der quantitativ Maßnahmen, dynamische multiparametrischer Reaktion lebender Systeme auf verschiedene Reize einschließlich Chemikalien und genetischen Störungen.
Durch globale metabolischen Profils durchgeführt wird, kann eine funktionelle Auslesen aus Zellen, Geweben und Blut erhalten werden. Darüber hinaus werden Informationen von Transkriptom Experimente spiegeln nicht immer tatsächlichen Veränderungen in der Höhe von Enzymen, die auf biochemischen Wege beitragen. KombinierteAnalyse von Daten Transkriptom und Metabolom ermöglicht es uns, mit den tatsächlichen Metaboliten Veränderungen Veränderungen in der Genexpression zu identifizieren und zu korrelieren. Die Nutzung der Informationen aus all diesen großen Maßstab Datensätze die mechanistischen Details liefern die Rolle von Transkriptionsfaktoren regulieren komplexer biologischer Systeme, vor allem diejenigen, die beziehen sich auf die menschliche Entwicklung und Krankheiten wie Krebs und Diabetes zu verstehen.
Die komplexe Natur des Säugetiergenoms macht es schwierig, zu integrieren und zu interpretieren, in vollem Umfang die von den Transkriptom erhaltenen Daten, cistrome und Metabolom Experimente. Identifizieren funktionelle Bindungsereignisse, die, weil, sobald Bindungsstellen funktionell sind identifiziert Veränderungen in der Expression von Zielgenen ist wichtig, führen würde; anschließenden Analyse, einschließlich Transkriptionsbindungs (TF) Motivanalyse, konnte mit einer höheren Genauigkeit durchgeführt werden. Dies führt zur Identifizierung von biologisch sinnvoll TF Kaskaden und Mechanismen. Auch direkte comparisauf der RNA-Seq und ChIP-Seq Versuche sind nicht immer möglich, da die Daten von jedem Experiment unterschiedlichen Skalen und Geräusche haben, und in einigen Fällen sinnvolle Signale werden von Bevölkerungs Rauschen verdeckt. Wir sind keine Kenntnis von einer Studie, die Informationen aus diesen drei unabhängigen, aber miteinander verbundene Ansätze integriert, um die direkte Stoffwechselregulation durch ERa bei Brustkrebs zu verstehen. Deshalb ist unser übergeordnetes Ziel in dieser Arbeit ist produktive Bindungsereignisse zu Genexpression und Metaboliten Veränderungen zu beziehen. Um dieses Ziel zu erreichen, integriert wir Daten von RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und identifiziert jene Östrogen ERa Bindungsereignisse induziert, die zu Veränderungen der Genexpression in Stoffwechselwege führen würde. Zum ersten Mal bieten wir einen kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1) zur Erzeugung von ChIP-Seq, RNA-Seq und Metabolomik Profilierung und Durchführung integrative Analyse der Daten neue Gen – Schaltungen aufzudecken Stoffwechsel der Brust RegulierungKrebszelllinien.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit haben wir beschrieben, Erzeugungs- und integrative Analyse von RNA-Seq, ChIP-Seq und metabolomics Daten von MCF-7-Zellen, die mit E2 behandelt werden. Wir entwickelten eine Reihe von Protokollen, die effizientesten Methoden und benutzerfreundlichen Soft-Ware zu verwenden strategizing, die biologisch relevante Entdeckung produzieren. Um unser Wissen, unsere ist die erste Studie -omics Daten aus drei verschiedenen Analysen und identifiziert neue Stoffwechselwege, die ERa direkt geregelt in Brustkrebszelle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft, US Department of Agriculture, preis ILLU-698-909 (ZME) und Pfizer, Inc (ZME) unterstützt. Sein Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht zwangsläufig die offizielle Einstellung der US-Landwirtschaftsministerium vertreten.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
- Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
- Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
- Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
- Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
- Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).
