乳癌におけるエストロゲン受容体シグナル伝達によって代謝制御のシステムバイオロジー
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
-omicsの出現により、がんやメタボリックシンドロームなどの慢性疾患の我々の理解が向上した近づきます。しかし、遺伝子発現マイクロアレイから得られる大規模なデータセット、深いシーケンシング実験または代謝プロファイリングにおける情報の効果的な採掘が明らかにした後、効果的に病気の細胞の表現型の重要な調節因子を標的とすることが不可欠です。エストロゲン受容体α（ERα）は、エストロゲン応答性乳癌のために重要である遺伝子プログラムを制御するマスター転写因子の一つです。乳がん代謝におけるERαシグナル伝達の役割を理解するために、我々はトランスクリプトーム、エストラジオールで処理されたMCF-7細胞からcistromicとメタボロームデータを利用しました。この報告では、RNAのSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクス実験と得られたデータの統合的なコンピュータ分析のためのサンプルの生成を説明しました。このアプローチは、新規モルの輪郭を描くのに有用ですcularメカニズムおよび正常または疾患細胞の影響代謝特定の転写因子によって調節されている遺伝子調節回路。
Introduction
エストロゲンは生殖組織、代謝組織、脳や骨1を含む。女性と男性の両方における多くの生理学的プロセスの重要な調節因子です。これらの組織において有益な効果に加えて、エストロゲンはまた、乳房および生殖組織から生じる癌を駆動します。エストロゲンは主に細胞型特異的な効果を誘導することのERを介して動作します。 ChIP-のSeqを用いてRNA-のSeqとゲノムワイドERαDNA結合部位の解析を使用してERαによって調節転写産物のディープシーケンシングは、ERαがそれらから生じる異なる組織および癌においてどのように動作するかを理解するのに有用であることが判明しました。我々と他の人は、異なる受容体（ERβ対ERα）2,3、異なるリガンド3-5と異なるコレギュレーター2,4,6,7に関連した遺伝子発現プロファイルを公開しています。
RNA-のSeqは、マイクロアレイBAと比較して、より高い精度と効率を提供し、トランスクリプトームを検討するための主要な方法であり、sedの遺伝子発現解析8。細胞株2-4,7、組織または腫瘍試料から得られたRNAは、利用可能なゲノムアセンブリにマッピングされ、配列決定され、示差的に調節する遺伝子が同定されます。クロマチン免疫沈降（チップ）は、公知の調節結合部位に結合する転写因子および補調節因子、クロマチンを分析するために使用されます。 ChIP-のSeq（ハイスループットシークエンシングに続いてのChIP）は、グローバル結合部位の公正な検出を提供します。メタボロミクスは別ますます使用されるシステム生物学のアプローチ、定量的に測定し、化学物質や遺伝的摂動を含む様々な刺激に対する生体系の動的マルチパラメトリック応答です。
グローバル代謝プロファイリングを行うことにより、機能的な読み出しは、細胞、組織、及び血液から得ることができます。また、トランスクリプトーム実験からの情報は常に生化学的経路に貢献する酵素のレベルの実際の変化を反映するものではありません。合わせましたトランスクリプトームとメタボロームデータの分析は、実際の代謝物の変化と遺伝子発現の変化を識別し、相関させることを可能にしています。すべてのこれらの大規模なデータセットからの情報を活用することは、複雑な生物学的システムを調節する転写因子、人間開発とがんや糖尿病などの疾患に関連し、特にものの役割を理解するために機械的な詳細を提供します。
哺乳動物ゲノムの複雑な性質は、それが困難な統合と完全にトランスクリプトーム、cistromeとメタボローム実験から得られたデータを解釈することができます。一旦機能的結合部位が同定されているため、標的遺伝子の発現の変化をもたらす機能的結合事象を同定することが重要です。転写結合（TF）モチーフの分析を含む分析し、その後、より高精度に行うことができます。これは、生物学的に意味のあるTFカスケードおよびメカニズムの同定をもたらします。また、直接comparis各実験からのデータは、異なるスケールとノイズを持っており、いくつかのケースでは意味のある信号が人口ノイズによって覆い隠されているので、RNAのSeqとチップのSeq実験の上で常に可能ではありません。我々は、乳癌におけるERαによる直接の代謝調節を理解するために、これらの三つの独立が関連のアプローチからの情報を統合し、任意の研究を認識していません。そこで、本論文では、当社の全体的な目標は、遺伝子発現および代謝物の変化に生産的な結合事象を関連付けることです。この目標を達成するために、我々は、RNAのSeqチップ-のSeqおよびメタボロミクスの実験からのデータを統合し、代謝経路における遺伝子発現の変化をもたらすイベントを結合ERα誘導されるエストロゲンを同定しました。初めて、我々は乳房の代謝を調節する新規遺伝子回路を明らかにしたChIP-のSeq、RNA-のSeqとメタボロミクスのプロファイリングを生成し、データの統合的な分析を行うためのプロトコル（ 図1）の完全なセットを提供します癌細胞株。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、生成およびE2で処理されたMCF-7細胞からのRNA-のSeq、ChIPの-のSeqとメタボロミクスデータの統合的な分析を説明しました。私たちは、生物学的に関連の発見を生み出す最も効率的な方法でユーザーフレンドリーなソフト用品を利用するために戦略的なプロトコルのセットを開発しました。我々の知る限り、我々は、3つの異なる分析から-omicsデータを統合し、ERα直接乳癌細胞において?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立食糧農業研究所、米国農務省、受賞ILLU-698から909（ZME）とファイザー株式会社（ZME）からの助成金によってサポートされていました。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも米国農務省の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
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