유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
-omics의 출현으로 암과 대사 증후군과 같은 만성 질환에 대한 우리의 이해가 개선 된 접근한다. 그러나, 유전자 발현 마이크로 어레이 깊이 순서화 실험 대사 프로파일로부터 획득되는 대규모 데이터 집합의 정보를 효과적으로 마이닝 발견하는 것이 필수적이다하고 효과적으로 병든 세포 표현형의 중요한 표적 레귤레이터. 에스트로겐 수용체 α (ERα)은 에스트로겐 반응 유방암에 중요한 유전자 프로그램을 조절하는 마스터 전사 인자 중 하나입니다. ERα는 유방암 대사에 신호의 역할을 이해하기 위해서 우리는 에스트라 디올로 치료 MCF-7 세포에서 transcriptomic cistromic 및 메타 볼로 데이터를 이용했다. 이 보고서에서 우리는 RNA-서열, 칩 – 서열 및 대사 체학 실험 얻어진 데이터의 통합 전산 분석을 위해 샘플의 생성을 설명했다. 이 방법은 새로운 몰을 서술에 유용하다정상 또는 병에 걸린 세포의 영향 대사 특정 전사 인자에 의해 조절된다 큘라 메커니즘과 유전자 조절 회로.
Introduction
에스트로겐은 생식 조직, 대사 조직, 뇌와 뼈 하나를 포함하여 모두 여성과 남성의 많은 생리 학적 과정의 중요한 규제입니다. 이 조직에서의 유익한 효과에 더하여, 에스트로겐은 유방 및 생식 조직에서 발생하는 암을 구동한다. 에스트로겐은 주로 세포 유형 특정한 효과를 유도 ERS를 통해 작동한다. 칩-서열을 이용하여 RNA-서열 및 게놈 전체 ERα DNA 결합 부위 분석을 사용 ERα에 의해 규제 성적 증명서의 깊은 순서는 ERα 그들로부터 발생하는 다른 조직과 암에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 유용한 것으로 입증되었다. 우리와 다른 유전자 발현 (ERβ 대 ERα) 다른 수용체와 관련된 프로파일 2, 3, 다른 리간드 3-5 다른 coregulators 2,4,6,7를 발표했다.
RNA-서열은 마이크로 어레이 바에 비해 높은 정밀도와 효율성을 제공하는 전 사체를 검사하는 주요 방법입니다SED의 유전자 발현 분석 (8). 세포주 2-4,7, 조직 또는 종양 샘플에서 얻은 RNA 게놈이 가능한 어셈블리에 매핑 서열화되고 차등 조절 유전자 식별된다. 염색질 면역 침전 (칩)은 알려진 규정 결합 부위에 결합하는 전사 인자와 coregulator 염색질을 해부하기 위해 사용된다. 칩-SEQ (높은 처리량 시퀀싱 뒤에 칩)는 글로벌 결합 부위의 편견 검출을 제공한다. 대사 체학은 다른 점점 사용하는 시스템 생물학 접근, 정량적으로 측정, 화학 물질 및 유전 적 교란 등의 다양한 자극에 살아있는 시스템의 동적 multiparametric 반응이다.
글로벌 대사 프로파일 링을 수행하여, 판독 기능은 세포, 조직 및 혈액에서 수득 할 수있다. 또한, 사체 실험에서 정보는 항상 생화학 적 경로에 기여하는 효소의 수준에서 실제 변화를 반영하지 않습니다. 결합 된사체 및 대사 체 데이터의 분석을 확인하고 실제 대사 산물의 변화와 유전자 발현의 변화의 상관 관계를 우리에게 있습니다. 이러한 대규모 데이터 집합은 기계적 세부 사항을 제공 모두로부터 정보를 모으고 복잡한 생물학적 시스템, 인간 발달과 암, 당뇨병과 같은 질환들에 관련된 특히 조절 전사 인자의 역할을 이해한다.
포유 동물 게놈의 복잡한 본질은 도전 통합 완전히 사체, cistrome 대사 체 및 실험으로부터 얻은 데이터를 해석 할 수있다. 일단 기능적 결합 부위가 확인되어 있기 때문에 표적 유전자의 발현에 중요한 변화를 초래할 것이다 기능적 바인딩 이벤트를 식별하는 단계; 전사 바인딩 (TF) 모티브 분석을 포함, 분석 계속되는, 높은 정밀도로 수행 될 수있다. 이는 생물학적으로 의미있는 TF 캐스케이드 및 메커니즘의 식별을 이끈다. 또한 직접 comparis각 실험의 데이터가 저울과 소음을 다른 어떤 경우에는 의미있는 신호가 인구 노이즈에 의해 가려하는이 있기 때문에 RNA-서열 및 칩-SEQ 실험에 항상 가능한 것은 아니다. 우리는 유방암에 ERα에 의해 직접 신진 대사 조절을 이해하는 세 가지 독립적이지만 관련 접근 방식에서 정보를 통합하는 연구의 인식하지 못합니다. 따라서, 본 논문에서 우리의 전반적인 목표는 유전자 발현 및 대사 산물의 변화에 생산 바인딩 이벤트를 관련하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 칩-SEQ와 대사 체학 실험으로부터 데이터를 통합 및 대사 경로에서의 유전자 발현 변화를 야기 할 이벤트를 결합 ERα 유도 이러한 에스트로겐을 확인 하였다. 처음으로, 우리는 유방의 대사를 조절하는 신규 한 유전자 회로를 밝히기 위해서 칩 서열, RNA-SEQ와 대사 체학 프로파일을 생성하고, 상기 데이터의 통합 분석을 수행하기위한 프로토콜 (도 1)의 완전한 세트를 제공 할암 세포주.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문에서는 E2로 치료 MCF-7 세포에서 생성 및 RNA-서열, 칩 – 서열 및 대사 체학 데이터의 통합 분석을 설명했다. 우리는 생물학적으로 중요한 발견을 생산하는 가장 효율적인 방법과 사용자 친화적 인 부드러운 상품을 활용하는 전략 수립 프로토콜을 개발. 우리의 지식으로, 우리는 세 가지 분석 ERα 직접 유방암 세포 규제 식별 새로운 대사 경로에서 -omics 데이터를 통합하는 최초의 연구이다. </p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 식량 농업 연구소, 농업의 미국학과, 수상 ILLU-698-909 (ZME)과 화이자, Inc의 (ZME)에서 보조금에 의해 지원되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 농무부의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
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