Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Med bruk av -omics nærmer vår forståelse av kroniske sykdommer som kreft og metabolsk syndrom har økt. Imidlertid er effektiv utvinning av informasjonen i de store datasett som er hentet fra genuttrykk mikromatriser, dype sekvense eksperimenter eller metabolsk profilering viktig å avdekke og deretter effektivt målrette de kritiske regulatorer av syke celle fenotyper. Østrogen Reseptor α (ERα) er en av de hovedtranskripsjonsfaktorer som regulerer gener programmer som er viktige for østrogen responsive brystkreft. For å forstå rollen til ERα av signalering i brystkreft metabolisme benyttet vi transcriptomic, cistromic og metabolomic data fra MCF-7-celler behandlet med østradiol. I denne rapport beskrev vi generering av prøver for RNA-Seq Chip-Seq og metabolomics eksperimenter og den integrerende matematisk analyse av de oppnådde data. Denne tilnærmingen er nyttig for å kartlegge roman muldvarprund mekanismer og gen regulatoriske kretser som er regulert av en bestemt transkripsjonsfaktor som påvirker metabolismen av normale eller syke celler.
Østrogener er viktige regulatorer av mange fysiologiske prosesser i både kvinner og menn, inkludert reproduktive vev, metabolske vev, hjerne og bein 1. I tillegg til gunstige effekter i disse vev, østrogener også kjøre kreft som oppstår fra bryst og reproduktive vev. Østrogener hovedsakelig arbeide gjennom grunnleggende kravene for å indusere celletype spesifikke effekter. Deep sekvensering av vitnemål regulert av ERα hjelp RNA-Seq og genom-wide ERα DNA bindingssteder analyse ved hjelp av chip Seq viste seg å være nyttig for å forstå hvordan ERα fungerer i ulike vev og kreft som oppstår fra dem. Vi og andre har publisert genuttrykk profiler knyttet til ulike reseptorer (ERα vs ERβ) 2,3, forskjellige ligander 3-5 og ulike coregulators 2,4,6,7.
RNA-Seq er den viktigste metoden for å undersøke transkriptomet, som tilbyr høyere presisjon og effektivitet sammenlignet med microarray based genekspresjonsanalyse 8. RNA hentet fra cellelinjer 2-4,7, vev eller tumorprøver er sekvensert, kartlagt til tilgjengelige genomisk forsamlinger og ulikt regulert gener er identifisert. Chromatin Immunpresipitasjon (chip) er ansatt for å dissekere transkripsjonsfaktor og coregulator kromatin binding til kjente regulatoriske bindingssteder. ChIP-Seq (Chip etterfulgt av høy throughput sekvensering) gir deg objektive påvisning av globale bindingssteder. Metabolomics er et annet økende grad brukt system biologi tilnærming, som kvantitativt tiltak, dynamisk multiparametric respons av levende systemer på ulike stimuli, inkludert kjemikalier og genetiske forstyrrelser.
Ved å utføre global metabolsk profilering, kan en funksjonell avlesing oppnås fra celler, vev og blod. I tillegg trenger informasjon fra transkriptom eksperimenter ikke alltid gjenspeiler faktiske endringer i nivået av enzymer som bidrar til biokjemiske mekanismer. kombinertanalyse av transkriptom og metabolomet data gjør oss i stand til å identifisere og relatere endringer i genuttrykk med faktiske metabolitt endringer. Å utnytte informasjon fra alle disse store datasett gi mekanistiske detaljer for å forstå hvilken rolle transkripsjonsfaktorer som regulerer komplekse biologiske systemer, spesielt de som gjelder for menneskelig utvikling og sykdommer som kreft og diabetes.
Den komplekse natur av pattedyr genomet gjør det utfordrende å integrere og fullt tolke data innhentet fra transkriptom, cistrome og metabolomet eksperimenter. Identifisere funksjonelle bindende hendelser som ville føre til endringer i uttrykket av målgener er viktig fordi når funksjonelle bindingssteder er identifisert; påfølgende analyse, inkludert transkripsjon binding (TF) motiv analyse kan utføres med høyere nøyaktighet. Dette fører til identifisering av biologisk betydningsfulle TF kaskader og mekanismer. Også direkte comparispå RNA-sekv og chip-Seq eksperimenter er ikke alltid mulig, siden dataene fra hvert forsøk har forskjellige skalaer og støy, og i noen tilfeller meningsfylte signaler blir skjult av befolkningen støy. Vi kjenner ikke til noen studie som integrert informasjon fra disse tre uavhengige men beslektede tilnærminger for å forstå den direkte metabolsk regulering av ERα i brystkreft. Derfor vårt overordnede mål i denne artikkelen er å forholde produktive bindende hendelser til genekspresjon og metabolitt endringer. For å oppnå dette målet, integrerte vi data fra RNA-Seq, Chip-Seq og metabolomics eksperimenter og identifisert de østrogeninduserte ERα bindende hendelser som ville føre til genekspresjon endringer i metabolske veier. For første gang tilbyr vi et komplett sett med protokoller (figur 1) for å generere ChIP-Seq, RNA-Seq og metabolomics profilering og utføre integrerende analyse av data for å avdekke nye genet kretser som regulerer stoffskiftet av brystkreftcancercellelinjer.
I denne artikkelen har vi beskrevet generasjon og integrerende analyse av RNA-Seq Chip-Seq og metabolomics data fra MCF-7 celler som er behandlet med E2. Vi har utviklet et sett med protokoller strategizing å utnytte de mest effektive metoder og brukervennlige myke varer som produserer biologisk relevant funn. Så vidt vi vet, er vår den første studien å integrere -omics data fra tre ulike analyser og identifisert nye metabolske veier som ERα direkte regulert i brystkreftceller.
transcr…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, pris ILLUSTRASJON-698-909 (ZME) og Pfizer, Inc (ZME). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av US Department of Agriculture.
Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
DNTP MIX | NEB | N0447S | |
M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |