Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
Com o advento das -ómicas se aproxima de nossa compreensão das doenças crônicas como câncer e síndrome metabólica melhorou. No entanto, a mineração eficaz da informação nas bases de dados de grande escala que são obtidas a partir de microarrays de expressão genética, experimentos de seqüenciamento profundas ou perfil metabólico é essencial para descobrir e, em seguida, efetivamente alvo os reguladores críticos de fenótipos celulares doentes. Receptor de estrogênio α (ERa) é um dos fatores mestre de transcrição que regulam os programas de genes que são importantes para estrogênio cancros da mama responsivos. A fim de compreender o papel de ERa sinalização no metabolismo do cancro da mama que utilizaram dados transcriptomic, cistromic e metabolômica de células MCF-7 tratadas com estradiol. Neste relatório nós descrevemos a geração de amostras para RNA-Seq, Chip-Seq e experiências metabolômica e análise computacional integrativa dos dados obtidos. Essa abordagem é útil em delinear nova toupeiramecanismos cular e circuitos gene regulador que são regulados por um fator de transcrição especial que impacta metabolismo das células normais ou doentes.
Introduction
Os estrogênios são importantes reguladores de muitos processos fisiológicos em ambos os sexos, incluindo tecidos reprodutivos, tecidos metabólicos, cérebro e ossos 1. Em adição aos efeitos benéficos nestes tecidos, os estrogénios também conduzir cancros que surgem da mama e tecidos reprodutivos. Estrógenos trabalhar principalmente através ERs para induzir efeitos específicos do tipo de célula. sequenciamento profundo de transcritos regulados por ERa usando RNA-Seq e de todo o genoma DNA ERa análise de sítios de ligação usando o chip-Seq provou ser útil para entender como ERa trabalha em diferentes tecidos e tipos de câncer que surgem a partir deles. Nós e outros publicaram perfis da expressão de genes associados com receptores diferentes (ERa vs ERP) 2,3, diferentes ligantes 3-5 e diferentes coregulators 2,4,6,7.
RNA-Seq é o principal método para analisar o transcriptoma, oferecendo maior precisão e eficiência em comparação com ba microarrayanálise de expressão gênica sed 8. ARN obtido a partir de linhas celulares de 2-4,7, tecidos ou amostras de tumor são sequenciados, mapeados para montagens genómico disponíveis e genes diferencialmente regulados são identificados. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é empregada para dissecar o fator de transcrição e coregulator ligação a locais de ligação reguladoras conhecidas cromatina. ChIP-Seq (CHIP seguido de alta sequenciamento rendimento) fornece detecção imparcial de sítios de ligação globais. Metabolômica é uma outra abordagem da biologia sistema cada vez mais usado, que mede quantitativamente, a resposta multiparamétrico dinâmica dos sistemas vivos a vários estímulos, incluindo produtos químicos e perturbações genéticas.
Ao realizar perfil metabólico global, uma leitura funcional pode ser obtido a partir de células, tecidos e sangue. Além disso, as informações a partir de experimentos transcriptoma nem sempre refletem mudanças reais no nível de enzimas que contribuem para vias bioquímicas. Combinadoanálise de dados de transcriptoma e metaboloma nos permite identificar e correlacionar mudanças na expressão gênica com alterações de metabolitos reais. Aproveitando a informação de todos esses conjuntos de dados de grande escala fornecer os detalhes mecanicistas para compreender o papel de fatores de transcrição que regulam sistemas biológicos complexos, especialmente os que dizem respeito ao desenvolvimento humano e doenças como câncer e diabetes.
A natureza complexa do genoma dos mamíferos torna difícil para integrar e totalmente interpretar os dados obtidos a partir do transcriptoma, cistrome e metaboloma experimentos. Identificar eventos de ligação funcionais que levariam a alterações na expressão de genes-alvo é importante porque os locais de ligação, uma vez funcionais são identificados; análise subsequente, incluindo transcrição de ligação (TF) análise motivo, pode ser realizado com maior precisão. Isto leva à identificação de cascatas TF biologicamente significativas e mecanismos. comparis também diretosem experimentos de RNA-Seq e chip-Seq nem sempre são possíveis desde que os dados de cada experimento têm diferentes escalas e ruídos e, em alguns casos, sinais significativos são obscurecidos pelo ruído população. Não temos conhecimento de qualquer estudo que integrou informações dessas três abordagens independentes, mas relacionados para entender a regulação metabólica direta por ERa no cancro da mama. Portanto, nosso objetivo geral neste trabalho é relacionar eventos de ligação produtivas para a expressão do gene e alterações de metabolitos. Para atingir este objetivo, integrada dados de RNA-Seq, Chip-seq e metabolômica experiências e identificou aqueles estrogênio induzida ERa eventos que levariam a mudanças de expressão de genes em vias metabólicas vinculativo. Pela primeira vez, nós fornecemos um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolômica perfis e executar a análise integrada dos dados para descobrir circuitos novo gene que regulam o metabolismo da mamalinhas celulares de cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, nós descrevemos geração e análise integrativa da RNA-Seq, Chip-Seq e os dados de metabolômica de células MCF-7 que são tratadas com E2. Desenvolvemos um conjunto de protocolos strategizing para utilizar os métodos mais eficientes e usuário soft wares amigáveis que produzem descoberta biologicamente relevante. Para o nosso conhecimento, o nosso é o primeiro estudo para integrar -ómicas dados de três diferentes análises e identificadas novas vias metabólicas que ERa diretamente regulad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, concessão ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Departamento de Agricultura dos EUA.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
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