Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Med tillkomsten av omik närmar vår förståelse av de kroniska sjukdomar som cancer och metabolt syndrom har förbättrats. Det är dock viktigt att upptäcka en effektiv utvinning av informationen i de storskaliga datamängder som erhålls från genuttryck mikroarrayer, djupa sekvense experiment eller metabolisk profilering och sedan effektivt nå de kritiska regulatorer av sjuka celler fenotyper. Östrogenreceptor α (ERa) är en av de huvudtranskriptionsfaktorer som reglerar genen program som är viktiga för östrogenkänsliga bröstcancer. För att förstå att roll ERa signalering i bröstcancer metabolism utnyttjade vi transcriptomic, cistromic och metabolomic data från MCF-7-celler som behandlats med östradiol. I denna rapport har vi beskrivit generation av prover för RNA-Seq, ChIP-Seq och metabolomik experiment och integrerande beräknings analys av erhållna data. Detta tillvägagångssätt är användbar i avgränsar nya mullvadCular mekanismer och gen reglerande kretsar som regleras av en viss transkriptionsfaktor som påverkar metabolismen av normala eller sjuka celler.
Östrogener är viktiga regulatorer för många fysiologiska processer i både honor och hanar, inklusive reproduktiva vävnader, metaboliska vävnader, hjärna och ben 1. Förutom positiva effekter på dessa vävnader, östrogener driver också cancer som uppkommer från bröst och reproduktiva vävnader. Östrogener arbetar främst genom ER att inducera celltyp specifika effekter. Djup sekvensering av transkript regleras av ERa hjälp av RNA-Seq och genomet hela ERa DNA-bindningsställen analys med hjälp av chip-Seq visat sig vara användbara för att förstå hur ERa fungerar i olika vävnader och cancer som uppstår från dem. Vi och andra har publicerat genuttrycksprofilerna samband med olika receptorer (ERa vs ERP) 2,3, olika ligander 3-5 och olika coregulators 2,4,6,7.
RNA-Seq är den huvudsakliga metoden att undersöka transkriptom, erbjuder högre precision och effektivitet jämfört med microarray baSED genexpressionsanalys 8. RNA som erhållits från cellinjer 2-4,7, vävnader eller tumörprover sekvens mappas till tillgängliga iska församlingar och differentiellt reglerade gener identifieras. Kromatin Immunoprecipitation (chip) används för att dissekera transkriptionsfaktor och coregulator kromatin binder till kända regulatoriska bindningsställen. Chip-Seq (chip följt av hög genomströmning sekvensering) erbjuder objektiva detektering av globala bindningsställen. Metabolomics är en annan används alltmer systembiologi strategi som kvantitativt åtgärder, dynamisk multiparameter svar av levande system på olika stimuli inklusive kemikalier och genetiska störningar.
Genom att utföra global metabolisk profilering, kan en funktionell avläsning erhållas från celler, vävnader och blod. Dessutom har information från transkriptom experiment inte alltid återspegla de faktiska förändringar i nivån av enzymer som bidrar till biokemiska vägar. Kombineradanalys av transkriptom och Metabolome uppgifter gör att vi kan identifiera och korrelera förändringar i genuttryck med faktiska metabolit förändringar. Utnyttja information från alla dessa storskaliga datamängder ge mekanistiska detaljer att förstå betydelsen av transkriptionsfaktorer som reglerar komplexa biologiska system, särskilt sådana som hänför sig till mänsklig utveckling och sjukdomar som cancer och diabetes.
Den komplicerade karaktären av däggdjursgenomet gör det svårt att integrera och fullt tolka data som erhållits från transkriptom, cistrome och Metabolome experiment. Identifiera funktionella bindande händelser som skulle leda till förändringar i uttryck av målgener är viktigt eftersom när funktionella bindningsställen identifieras; efterföljande analys, inklusive transkription bindning (TF) motiv analys kunde utföras med större noggrannhet. Detta leder till identifiering av biologiskt meningsfulla TF kaskader och mekanismer. Också direkta comparispå av RNA-Seq och Chip-Seq experiment är inte alltid möjligt eftersom data från varje experiment har olika skalor och ljud och i vissa fall menings signaler skyms av befolkningen buller. Vi är inte medvetna om någon studie som integrerad information från dessa tre oberoende men relaterade metoder för att förstå den direkta metabolisk reglering av ERa i bröstcancer. Därför är vårt övergripande mål i detta dokument att relatera produktiva bindande händelser till genuttryck och metabolit förändringar. För att uppnå detta mål, integrerade vi data från RNA-Seq, Chip-Seq och metabolomik experiment och identifierade dem östrogen inducerad ERa bindande händelser som skulle leda till genuttryck förändringar i metaboliska vägar. För första gången erbjuder vi en komplett uppsättning protokoll (Figur 1) för generering av Chip-Seq, RNA-Seq och metabolomik profilering och utföra integrativ analys av data för att avslöja ny gen kretsar reglerar metabolismen av bröstcancercellinjer.
I detta dokument beskrivs vi generationen och integrativ analys av RNA-Seq, ChIP-Seq och metabolomik data från MCF-7-celler som behandlas med E2. Vi utvecklade en uppsättning protokoll strategizing att utnyttja de mest effektiva metoderna och användarvänliga mjuka varor som producerar biologiskt relevant upptäckt. Såvitt vi vet är vår första studie för att integrera omik data från tre olika analyser och identifierade nya metaboliska vägar som ERa direkt regleras i bröstcancerceller.
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture, utmärkelse ILLU-698-909 (ZME) och Pfizer, Inc (ZME). Dess innehåll är helt och hållet av författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter US Department of Agriculture.
Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
DNTP MIX | NEB | N0447S | |
M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |