في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
يقيس فحص القلوية المذنب فواصل حبلا الحمض النووي على مستوى خلية واحدة. هي جزء لا يتجزأ تعليق من الخلايا وحيدة في الاغاروز على شريحة المجهر والخلايا هي lysed لتشكيل nucleoids، والتي تحتوي على حلقات supercoiled من الحمض النووي. الكهربائي في الرقم الهيدروجيني> 13 النتائج في فقدان supercoiling في الحلقات الحمض النووي التي تحتوي على فواصل حبلا، مع فروع سراح من الحمض النووي الهجرة نحو القطب الموجب، وخلق هياكل تشبه المذنب التي يمكن ملاحظتها بواسطة المجهر مضان. الحمض النووي مجزأة يهاجر من "الرأس" من المذنب في "ذيل" على أساس حجم جزء، ومضان النسبي للذيل المذنب بالمقارنة مع كثافة الإجمالية (الرأس والذيل) يمكن استخدامها لتحديد الحمض النووي الكسر 1 ، 2. فحص بسيط، حساسة، وتنوعا، سريع، وغير مكلفة نسبيا 1. ويستخدم للكشف عن الحمض النووي مجزأة الناجمة عن عوامل ضارة الحمض النووي للفحص لتحديد كمية الحمض النووي من التلف في الخلايا أو عزل نواة من indiviالأنسجة المزدوج من الحيوانات تعامل مع المواد السامة للجينات يحتمل أن تكون (الصورة). نظرا لمزاياها، وأوصى في الجسم الحي المذنب مقايسة كما في الجسم الحي السمية الوراثية الفحص الثاني (يقترن في الجسم الحي للفئران الاختبار) لإجراء تقييم سلامة المنتجات في المؤتمر الدولي الحالي على مواءمة (ICH) (3) وهيئة سلامة الأغذية الأوروبية (EFSA ) 4 المبادئ التوجيهية التنظيمية. في المختبر، ونحن قد استخدمت فحص لتقييم في الحمض النووي من التلف الجسم الحي الناجم عن المكونات الغذائية والأدوية والمواد النانوية 5-10. وسيتم استخدام كبد الفئران كمثال في هذا البروتوكول، ولكن مقايسة المذنب لا يمكن أن يؤديها مع الأنسجة الأخرى / أجهزة حيوانات التجارب، طالما الخلايا واحدة سليمة يمكن عزلها عن الأنسجة.
أنواع معينة من الحمض النووي من التلف صعبة للكشف عن فواصل حبلا الحمض النووي من دون تعديل فحص القلوية المذنب الأساسي. في حالة الحمض النووي من التلف التأكسدي، حبلا بيمكن إنشاء reaks في الآفات التأكسدي في الحمض النووي عن طريق هضم مع الانزيمات إصلاح مثل الإنسان 8 oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1، مما يخلق فواصل في 8 oxoguanine (8 oxoGua) وميثيل fapy-جوانين 11. أيضا، نوكلياز داخلية الثالث (إندو الثالث) يخلق فواصل أساسا في البريميدينات أكسدة 1. وهكذا، إضافة خطوة انزيم الهضم يجعل فحص طريقة محددة وحساسة لقياس الحمض النووي من التلف التأكسدي في الجسم الحي (12). وباستخدام هذه المقايسات، لقد أثبتنا التي يسببها التسمم الحمض النووي من التلف التأكسدي في كبد الجرذان والفئران 6-8 وفي قلب الفئران 10.
فحص القلوية المذنب العديد من التطبيقات في علم السموم وراثية والرصد الحيوي الإنسان: 1)، ومتابعة في فحص الجسم الحي لgenotoxins التي حددها حساسة في المختبر اختبارات 3،13، 2) لتقييم آليات الحمض النووي من التلف الناجم عن أجنبي بيولوجيا في أنسجة متعددة 14، 3) للتحقيق في ما إذا كانمادة مسرطنة تعمل باستخدام السمية الوراثية أو وضع غير السمية العمل (وزارة الزراعة) 7، 4) لتقييم إصلاح الحمض النووي الضرر 15، 5) للتحقيق في الأمراض التي تصيب الإنسان والتعرض المهني 16، و 6)، ومحتمل الإنتاجية العالية فحص الكشف عن جهاز معين السمية الوراثية 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول قياس المتزامنة لكل من الحمض النووي من التلف التأكسدي المباشر وفي كبد الفئران على مستوى خلية واحدة. بروتوكول عام ينطبق على أي نوع من الأنسجة التي الخلايا وحيدة النواة أو يمكن أن تكون معزولة مع الحد الأدنى من الحمض النووي من التلف الناجم عن تصنيع (?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the ‘comet’ assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
