In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
O ensaio cometa alcalino mede rupturas dos filamentos de DNA no nível de uma única célula. As suspensões de células únicas são incorporados em agarose sobre uma lâmina de microscópio e as células lisadas para formar nucleoids, que contêm circuitos de super-enrolados ADN. Eletroforese em pH> 13 resulta na perda de supercoiling em loops de DNA contendo quebras de fita, com os fios libertados de DNA migram para o ânodo, a criação de estruturas semelhantes a cometas que podem ser observados por microscopia de fluorescência. ADN fragmentado migra a partir da "cabeça" do cometa na "cauda" com base no tamanho do fragmento, e a fluorescência relativa da cauda do cometa em comparação com a intensidade total (cabeça e cauda) pode ser utilizado para quantificar a quebra do ADN 1 , 2. O ensaio é simples, sensível, versátil, rápido, e relativamente barato 1. A detecção de ADN fragmentado causada por agentes que danificam o DNA é usado um ensaio para quantificar os danos no DNA em células ou isolado a partir de núcleos inditecidos duplos de animais tratados com o material potencialmente genotóxico (s). Devido às suas vantagens, o ensaio cometa in vivo é recomendada como um segundo ensaio in vivo genotoxicidade (emparelhado com o ensaio de micronúcleos in vivo) para a realização de avaliações de segurança de produtos no actual Conferência Internacional de Harmonização (ICH) 3 e Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA ) 4 diretrizes regulamentares. Em nosso laboratório, nós empregamos o ensaio para avaliar danos DNA vivo induzida por ingredientes alimentares, produtos farmacêuticos e nanomateriais 5-10. fígado de rato vai ser utilizado como exemplo neste protocolo, mas o ensaio de cometa pode ser realizado com outros tecidos / órgãos de animais experimentais, desde que as células individuais podem ser isoladas intactas a partir do tecido.
Certos tipos de danos no DNA são difíceis de detectar, como rupturas dos filamentos de DNA sem modificar o ensaio cometa alcalino básico. No caso de dano oxidativo ao DNA, costa breaks podem ser criados em lesões oxidativas em ADN por digestão com enzimas de reparação, tais como humano 8-oxoguanina-ADN-N-glicosilase 1 (hOGG1, que cria intervalos de 8-oxoguanina (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. além disso, endonuclease III (Endo III) cria intervalos principalmente em pirimidinas oxidados 1. Assim, a adição de um passo de digestão enzimática torna o ensaio de um método específico e sensível para medir lesões oxidativas do ADN in vivo 12. Utilizando estes ensaios, que demonstraram lesões oxidativas do ADN induzida por agente tóxico no fígado de ratos e ratinhos de 6-8 e no coração de ratos 10.
O ensaio cometa alcalino tem muitas aplicações em toxicologia genética e biomonitorização humana: 1) como um follow-up ensaio in vivo para genotoxinas identificadas pela sensível in vitro testa 3,13, 2) para avaliar mecanismos de dano ao DNA induzido xenobióticos em vários tecidos 14, 3) para investigar se acancerígena funciona utilizando um modo não-genotóxica de ação (MOA) 7 genotóxicos ou, 4) para avaliar DNA reparação de danos 15, 5) para investigar doenças humanas e exposições ocupacionais 16, e 6) como um potencial ensaio de rastreio de alto rendimento para -órgão específico genotoxicidade 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a medição simultânea tanto dos danos de ADN directa e oxidativo no fígado de rato ao nível da célula individual. O protocolo geral é aplicável a qualquer tecido a partir do qual as células individuais ou núcleos podem ser isolados com o mínimo de danos de DNA induzidos por transformação (isto é, danos no ADN induzida não pelo agente de teste, mas pelo manuseamento e processamento dos tecidos animais). Em nossa pesquisa, realizamos ensaios cometa alcalino em células da med…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
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