Analyse fonctionnelle complémentation (FCA): Un exercice de laboratoire conçu et mis en complétant l'enseignement des voies biochimiques

Summary

La validation des activités enzymatiques impliquées dans les voies biochimiques peut être élucidée en utilisant une analyse de complémentation fonctionnelle (CAF). Décrite dans ce manuscrit est le dosage CAF démontrant l'activité enzymatique des enzymes impliquées dans le métabolisme des acides aminés, de réponse stringente bactérienne et la biosynthèse du peptidoglycane bactérien.

Abstract

Functional dosage de complémentation (FCA) est un test in vivo qui est largement utilisé pour élucider la fonction / rôle des gènes / enzymes. Cette technique est très courante dans la biochimie, de la génétique et de nombreuses autres disciplines. Une vue d'ensemble de la technique pour compléter l'enseignement des voies biochimiques relatives aux acides aminés, peptidoglycane et la réponse stricte bactérienne est signalée dans ce manuscrit. Deux ADNc de l'organisme modèle Arabidopsis thaliana plante qui sont impliqués dans le métabolisme de la lysine (L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) et de la tyrosine aminotransferase (tyrB) impliqués dans le métabolisme de la tyrosine et phénylalanine sont surlignés. En outre, le peptidoglycane bactérien voie anabolique est mis en évidence par l'analyse de la -acetylmuramoyl-l-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) gène UDP- N à partir de la bactérie Verrucomicrobium spinosum impliqué dans la croix-linking de peptidoglycane. La réponse rigoureuse bactérienne est également signalé par l'analyse de l'rsh (POT h de omolog de ​​r ela / s) gène bifonctionnel responsable d'un phénotype hyper-muqueux dans la bactérie Novosphingobium sp. Quatre exemples de FCA sont présentés. La vidéo se concentrera sur trois d'entre eux, à savoir la lysine, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse.

Introduction

complémentation fonctionnelle dans le contexte d'élucider la fonction (s) / rôle (s) d'un gène est défini comme la capacité d'un homologue particulier ou d'un gène orthologue pour restaurer un mutant particulier avec un phénotype observable à l'état sauvage lorsque l'homologue ou d'un gène orthologue est introduit en cis ou trans dans l'arrière – plan mutant. Cette technique a été largement utilisée pour isoler et identifier la fonction (s) / rôle (s) de nombreux gènes. Un exemple particulier est l'isolement et l' identification des orotidine-5-phosphate décarboxylase de Candida albicans en utilisant le mutant ura3 de S. cerevisiae et du mutant pyrF E. coli. ¹ Les auteurs ont utilisé cette technique pour élucider la fonction des gènes qui sont impliqués dans le métabolisme des acides aminés, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse dans leurs programmes de recherche et ont incorporé cette technique dans leurs programmes d'enseignement dans le BBIOTECHNOLOGIE et programme au Rochester Institute of Technology (RIT) Molecular Bioscience (BMB).

Les auteurs enseignent Fondements de végétaux Biochimie / Pathologie (FPBP) (Hudson) et Bioseparations: Principes et pratiques (BPP) (Hudson / Savka), deux cours basés division laboratoire supérieure élective dans le programme BMB au RIT. Depuis quelques-uns des sujets qui sont abordés dans les cours sont affiliés à leurs intérêts de recherche, les auteurs ont intégré un grand nombre de techniques et d'outils expérimentaux qui sont utilisés dans leurs programmes de recherche respectifs dans ces deux cours en laboratoire. Un tel exemple est complémentation fonctionnelle comme un exercice de laboratoire pour renforcer les documents de cours relatifs aux acides métabolisme des acides à partir de plantes, peptidoglycane et le métabolisme de réponse rigoureuse à partir de bactéries.

Trois des voies d'acides aminés à partir de plantes qui sont abordés dans le cours FPBB sont celui de la lysine (LYS), tyrosine(Tyr) et de la phénylalanine (Phe). La voie est mise en évidence dans le lys cours en raison de l'importance de l'acide aminé comme un acide aminé essentiel pour tous les animaux en particulier les humains puisque les animaux manquent de la machinerie génétique pour synthétiser lys de novo. En outre, on a récemment découvert que les plantes utilisent une voie pour la synthèse de lys qui est significativement différente de celle des bactéries. Cette découverte a été facilitée en partie par complémentation fonctionnelle de E. coli diaminopimélate (PAH) des mutants en utilisant un gène qui code pour l'enzyme L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) à partir du Arabidopsis thaliana plante modèle. ² Les variantes de voies pour la synthèse de Lys à travers la diaminopimélate intermédiaire sont représentés sur la figure 1. En outre , la synthèse de lys facilite par la famille de aspartate dérivée d'acides aminés qui est très réglementé. ³ en plus de leur importance en protéines synthesis, les voies de Tyr et Phe sont mis en évidence compte tenu de leur importance dans le service en tant que composés précurseurs pour l'anabolisme des composés phénylpropanoïdes impliqués la synthèse de composés de défense des plantes telles que:. alcaloïdes, les lignines, les flavonoïdes, les isoflavonoïdes, l' acide hydroxycinnamique entre autres ⁴ Le tyr et les voies de Phe sont également mis en évidence pour montrer la différence entre la plante et les voies anaboliques bactériennes. Chez les bactéries, la tyrosine aminotransférase enzyme (tyrB) est impliquée dans l'anabolisme des deux acides aminés, tandis que chez les végétaux, l'enzyme est principalement impliqué dans le catabolisme de Tyr et Phe, et n'a pas été impliqué dans l'anabolisme de ces acides aminés. (Figure 2) ^4.

Les différences entre Gram positif et les bactéries Gram négatives en ce qui concerne la structure du peptidoglycane (PG) sont mis en évidence au cours de FPBP. La PG de bactéries Gram négatives est d'un intérêt en ce qui concerne la pathologie végétale sur la base du fait que la plupartpathogènes des plantes sont Gram négatif. Une étude récente concernant les 10 bactériennes phyto-pathogènes a révélé que tous sont Gram négatif. Les bactéries ont été parmi les genres Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya et Pectobacterium ⁵ L' une des différences chimiques lors de la comparaison de la souche PG de bactéries Gram négatif et Gram positif est la différence entre la réticulation amino. les acides des deux types. La première étape pour que différente réticulation du PG se produit à l'étape cytoplasmique de PG anabolisme et est facilitée par l'enzyme UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) (figure 3A). Mure catalyse l'addition d'un composé de diamine particulier à la troisième position de la tige de peptide ^6. Dans la plupart des bactéries Gram – négatives, les lys pénultième précurseur, méso -diaminopimelate ( <em> m -DAP) sert de réticulation amino – acide et sert Lys le même rôle dans la PG de la plupart des bactéries Gram – positives (figure 3B). ⁷ Ceci est dû au fait qu'à la fois m et -DAP Lys possèdent deux amine groupes et sont capables de former deux liaisons peptidiques pour la tige de peptide réticulation.

Dans les Bioséparations: Principes et pratiques (BPP) Bien sûr, les différences entre les systèmes ouverts et fermés pour la culture de bactéries et comment nutriment niveaux va changer de manière significative dans les deux systèmes en raison de changements environnementaux sont discutés. Ces événements sont liés aux changements réglementaires appelés un «décalage vers le bas" ou "shift up" déclenché par la faim ou une quantité suffisante d'acides aminés ou de l'énergie. La réponse «rétrograder» peut se produire quand une culture bactérienne est transférée à partir d'un milieu riche et complexe à un milieu défini chimiquement avec une source de carbone unique. Ce changement dans l'environnement conduit à la Cessa rapidetion de la synthèse ARNt et ARNr. Cette cessation résulte en l'absence de ribosomes, les protéines et la synthèse d'ADN, même si la biosynthèse des acides aminés sont régulés à la hausse.

Après la réponse «rétrograder», les ribosomes existants sont utilisés pour produire de nouvelles enzymes pour synthétiser les acides aminés ne sont plus disponibles dans le milieu ou l'environnement. Après une période de temps, la synthèse de l'ARNr et les nouveaux ribosomes sont assemblées et la population de cellules bactériennes commence à croître mais à un taux réduit. Le cours des événements est appelé la «réponse stricte» ou «contrôle strict» et est un exemple de la régulation cellulaire globale et peut être considéré comme un mécanisme de réglage des machines biosynthétique de la cellule pour compenser la disponibilité des substrats nécessaires et les besoins énergétiques . ⁸ la réponse rigoureuse permet ainsi aux bactéries de répondre rapidement aux flux de nutriments dans l'environnement et contribue et enhances la capacité des bactéries à concourir dans des environnements qui peuvent changer rapidement en ce qui concerne la disponibilité des nutriments et ou du substrat. ^9/8

La réponse rigoureuse a un rôle essentiel dans l' expression du gène lorsque la disponibilité des acides aminés, le carbone, l' azote, le phosphate et les acides gras sont limités. ^8,10-14 Cette réponse rigoureuse est coordonné par deux nucléotides, guanosine tétraphosphate (ppGpp) et guanosine pentaphosphate (pppGpp) communément appelé ensemble comme le alarmone (p) ppGpp. Par exemple, lorsque les acides aminés sont limitées, ce qui peut conduire à un goulot d'étranglement dans la synthèse des protéines, la alarmone, la guanosine 3,5- (bis) Pyrophosphate (ppGpp), dérivée de l'anabolisme de la guanosine diphosphate-3 5-triphosphate (pppGpp) accumule dans la cellule. Le changement de niveau (p) ppGpp est impliqué dans l'expression des gènes qui régulent la réponse à surmonter le manque de substrats dans l'environnement qui sont directement impliqués dans la croissance cellulaire et développement. Deux des gènes qui sont impliqués dans ce processus sont appelés relA et spoT. RelA est un ribosome associé (p) ppGpp synthétase qui est impliquée dans la réponse à l'accumulation des ARNt non chargés qui est le résultat de la limitation de l'acide aminé. fonctions repèrer comme bifonctionnel (p) ppGpp synthétase et hydrolase. L'activité de synthétase de repèrer est impliqué dans la réponse à l'absence de carbone et d' acide gras famine. ⁸ Les homologues RelA / Tache sont répandus dans les plantes et les bactéries et sont appelées rsh R ela / S POT h omologs. ^{8,10 -12,16} un manuscrit récent a montré qu'il existe une protéine rsh spécifique impliquée dans la synthèse de ces alarmones de la bactérie Novosphingobium sp Rr 2-17 ^17.

Nous présentons ici quatre voies biochimiques attachés aux essais de complémentation fonctionnelle. Les essais de complémentation décrites dans ce manuscrit fournit une avenue pour explminerai utilisant ce test in vivo comme un moyen d'identifier et de caractériser ou des enzymes qui sont prévues pour avoir une fonction inconnue / putative (s) ou comme outils d'enseignement pour compléter l'enseignement des voies biochimiques.

Protocol

NOTE: Les auteurs sont prêts à fournir des souches bactériennes et les plasmides recombinants pour faciliter l'incorporation de l'analyse de complémentation fonctionnelle à des fins d'enseignement pour les personnes qui sont intéressées. Les plasmides qui ont été utilisés pour faciliter les expériences de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 1. 1. Construction de Plasmides pour la complémentation fonctionnelle Cl…

Representative Results

Les souches bactériennes qui sont utilisés dans les différentes analyses de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 2. Analyse fonctionnelle de complémentation: L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPL) E. coli mutant double AOH1 (Δ :: dapD Kan2, dapE6) héberge une mutation dans le gène…

Discussion

Bon nombre des cours qui font partie intégrante de la biotechnologie et de curriculum bioscience moléculaire à l'Institut de technologie de Rochester ont une composante de laboratoire en plus de la partie de lecture du cours. Le programme d'études pour l'année scolaire 2014-2015 contient un total de 48 cours, dont 29 contiennent un composant de laboratoire qui représentent environ 60%. Un tel cours est Fondements de la biochimie et de pathologie des plantes (FPBP), une conférence / cours de laboratoir…

Materials

E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01