Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors
Summary
Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.
Abstract
Die Analyse von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und ihre Interaktion in vaskulären biology beteiligt Liganden ist oft eine Herausforderung aufgrund der konstitutiven Expression von Familien von verwandten Rezeptoren, ein breites Spektrum von verwandten Liganden und der Schwierigkeit, mit primären Kulturen von spezialisierten Endothelzellen handelt. Hier beschreiben wir einen Bioassay zum Nachweis von Liganden an den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (VEGFR-2), einem Schlüssel Wandler von Signalen, die Angiogenese und Lymphangiogenese fördern. Eine cDNA, die eine Fusion des extrazellulären (Liganden-bindenden) -Region von VEGFR-2 mit der Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR) ist in der faktorabhängigen Zelllinie Ba / F3 ausgedrückt. Diese Zellinie wächst in Gegenwart von Interleukin-3 (IL-3) und Entnahme dieses Faktors führt zu dem Tod der Zellen innerhalb von 24 Std. Die Expression des VEGFR-2 / EpoR-Rezeptor-Fusions stellt einen alternativen Mechanismus Überleben und Potentia zu fördernlly Proliferation von stabil transfizierten Ba / F3 – Zellen in Gegenwart eines Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Teil des Fusionsproteins (dh eine , die kann vernetzen die VEGFR-2 extrazellulären Region). Der Test kann in zwei Arten durchgeführt werden: eine semi-quantitative Ansatz, bei dem kleine Mengen von Ligand und die Zellen in 24 Stunden ein schnelles Ergebnis ermöglichen und eine quantitative Ansatz, der Surrogatmarker einer Lebendzellzahl. Der Test ist relativ einfach durchzuführen, ist in hohem Maße reaktions bekannten VEGFR-2-Liganden und extrazellulären Inhibitoren der VEGFR-2-Signalisierungs wie monoklonale Antikörper gegen den Rezeptor oder Liganden und lösliche Ligandenfallen aufnehmen kann.
Introduction
Die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) -Familie von sekretierten Protein Wachstumsfaktoren und ihre verwandten Zelloberflächenrezeptoren eine wichtige und vielfältige Gruppe von löslichen Liganden und Membran eingebettetem Rezeptoren bzw. diese Funktion in Signale über Zellmembranen transduzieren. Sie funktionieren vorwiegend in Endothelzellen , sondern auch in Zellen epithelialen Ursprungs und diejenigen des Immunsystems 1,2. Signalisierungs Eingriff Wege durch Liganden-aktivierte VEGF-Rezeptoren (VEGFRs) sind kritisch in großen Pathologien, wie altersbedingte Makuladegeneration und Krebs und Therapeutika ihnen sind in häufigen klinischen Gebrauch (zum Beispiel der monoklonale Antikörper Bevacizumab, die VEGF-A Targets) Targeting 3,4.
Einer der Komplexität der VEGF-Familie ist die Vielfalt der löslichen Liganden in der Natur (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Proteine durch die Parapockenvirusfamilie orf und Schlangengift VEGF codiert, plus andere hemmendIsoformen von VEGF-A) 2.
Diese Liganden interagieren mit drei Mitgliedern der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Familie, nämlich VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3. Diese Rezeptoren sind variabel auf verschiedenen Zelltypen exprimiert werden jedoch oft coexprimiert auf der Oberfläche von endothelialen Zellen , die Blut und Lymphgefäße aller Größen 5 auskleiden. VEGFR-2 binden kann die Säugetier-VEGF-A 6, VEGF-C – 7 und VEGF-D 8,9 sowie orf – Virus VEGF 10 und Schlangengift VEGF 11 – Liganden. VEGFR-2 spielt eine wichtige Rolle der Angiogenese (das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen) in der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Krebs und Augenkrankheiten in Fahrt. In diesen Zusammenhängen Liganden wie VEGF-A, -C und -D binden und aktivieren den Rezeptor auf den Blut vaskulären Endothelzellen 12-15. Auf lymphatischen Endothelzellen spielt VEGFR-2 eine Rolle bei der Lymphangiogenese, die Bildung neuer Lymphgefäße 16. VEGFR-2 kann auch 17 Erweiterung und den Ausbau der großen Arterien und Lymphgefäße in gesunden Geweben und Krankheiten zu fördern. Ein vollständiges Verständnis von VEGFR-2: Ligand – Wechselwirkungen ist daher wichtig für die Entwicklung von Inhibitoren für die Verwendung in 18 – Angiogenese-abhängigen Erkrankungen zu behandeln. Während die meisten Isoformen von VEGF-A – Bindung an VEGFR-2 wird proteolytische Spaltung von VEGF-C und VEGF-D erforderlich , der VEGF-Homologiedomäne ein Fragment freizusetzen , besteht, die die Bindung an VEGFR-2 19,20 eine hohe Affinität aufweist.
Wir haben ein Bioassay entwickelt Liganden von VEGFR-2 zu überwachen , die ausgelegt ist , die Notwendigkeit einer primären Endothelzellen zu umgehen, die für den Durchgang technisch schwer, teuer in der Anschaffung und die Kultur (erfordern spezielle Medium) 21 und mehrere VEGFRs exprimieren und co- assoziierten Rezeptoren 22. Heterodimerisierung von VEGFR-2 mit anderen VEGF-Rezeptoren oder Co-Rezeptoren können unerwünschte Komplexität verursachen, wenn sie zu dem Ziel Bolzeny binäre Rezeptor-Ligand – Wechselwirkungen, Aktivität zurückzuführen auf einen spezifischen Rezeptor bewerten, oder die Wirkung von hemmenden Reagenzien zu beurteilen. 23. Der Bioassay behält Beweglichkeit des entsprechenden Rezeptor in der Zellmembran und erlaubt die Bewertung der Fähigkeit eines Liganden zu binden und zu vernetzen, das VEGFR-2-extrazelluläre Region.
Der Bioassay beruht auf der Schaffung eines chimären Rezeptors, in dem die extrazelluläre Region eines VEGF-Rezeptors (in diesem Fall VEGFR-2) an die Transmembran- geschmolzen und intrazellulären Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR), ein Mitglied der Zytokin-Rezeptor-Familie 8,24. Dieses Fusionsprotein wird dann in der faktorabhängigen Pro-B-Zelllinie Ba / F3, auf die Stimulation mit einem Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Domäne des Rezeptors verursacht die Aktivierung der cytoplasmatischen Effektorregion exprimiert, die fähig ist, von ein Überlebenssignal über Janus-Kinasen (JAKs) Umwandlungs-Zelle zu fördernÜberleben und / oder Proliferation. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Volllängen-VEGFR-2 in dem gleichen Zelltyp, und die Stimulation mit dem Liganden, was anzeigt, nicht das Überleben der Zelle und die Proliferation fördert, dass der proximale Signalisierungs Effektoren des VEGFR-2-Weg in diesem Zelltyp nicht verfügbar sind.
Wir haben den Test in einer Vielzahl von Kontexten verwendet zu erforschen Bindung von neuartigen VEGFR-2 – Liganden 10,19,20,24-29. In Kombination mit einer VEGFR-3-EpoR-Ba / F3 – Assay haben wir die relativen Aktivitäten der VEGF-C und VEGF-D – Wachstumsfaktoren für die Bindung und Vernetzung VEGFR-2 und VEGFR-3 30 verglichen. Der Test wurde durchgeführt 31 , um die inhibitorische Aktivität von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern gegen VEGFR-2 oder VEGF-D, VEGFR-2 lösliches Falle und Peptidomimetika Targeting der VEGF – Familie zu charakterisieren. Der Test wurde auch in primären Endothelzellen zu zeigen, die Fähigkeit von VEGF aus verschiedenen orf-Virus-Stämme zu binden und zu vernetzen, VEGFR-2 vor dem Test verwendet <sup> 10,26. Der Test ist besonders nützlich für das schnelle Screening von Mutanten von VEGFs , die schnell auf ihre Aktivität untersucht werden können , bevor sie den mühsamer Endothelzelle Assays eingeführt werden , 25 oder bei der Beurteilung Protokolle zur Reinigung von Wachstumsfaktoren 27.
Der Test wir beschreiben, ist einfach durchzuführen, und die semi-quantitative Version ermöglicht eine schnelle Bestimmung, die manchmal erforderlich sind, wenn die Herstellung oder Reinigung von Wachstumsfaktoren überwacht wird, Antikörper oder löslicher Rezeptordomänen für andere Experimente. Die einfache Bedienung des Assays ist es eine ideale Ergänzung zu weiteren und umfassendere Studien mit primären endothelialen Zellen aus Blut oder Lymphgefäße aus bestimmten Geweben oder Organsysteme abgeleitet durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Test hier beschriebenen beruht auf Zellen hoher Lebensfähigkeit mit Hilfe der für Wachstumsfaktoren abhängig sind. Zellen müssen daher sorgfältig kultiviert werden sie Faktor abhängig zu gewährleisten, und die Expression des chimären Rezeptors binden. Um sicherzustellen, dass das Medium frisch hergestellt ist und nicht für einen zu langen Zeitraum gespeichert und dass WEHI-3D-CM ist hochaktiv ist wichtig. Zellen benötigen, von IL-3 enthaltendem Medium in das Assaymedium gründlich gewaschen werden, um sich…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
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