Summary
نحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأمعاء نقص التروية ضخه في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر الميدان. ويمكن استخدام هذا النموذج من الأمعاء إصابة نقص التروية ضخه لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.
Abstract
نقص تروية الأمعاء هو حالة تهدد الحياة المرتبطة مع مجموعة واسعة من الحالات الطبية بما في ذلك تصلب الشرايين والجلطة، انخفاض ضغط الدم، التهاب الأمعاء الناخر، زرع الأمعاء، والصدمات النفسية والالتهابات المزمنة. المعوية إصابة نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) هي نتيجة لنقص التروية المساريقي الحاد، والناجمة عن عدم كفاية تدفق الدم من خلال الأوعية المساريقي، مما أدى إلى تلف الأمعاء. يمكن ضخه نقص التروية التالية يزيد من تفاقم الضرر من الأمعاء. آليات إصابة الأشعة تحت الحمراء معقدة وغير مفهومة. ولذلك، نماذج حيوانية صغيرة تجريبية حاسمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الأشعة تحت الحمراء وتطوير علاجات جديدة.
نحن هنا وصف نموذج الفأر من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية الحادة التي توفر اصابة استنساخه من الأمعاء الدقيقة دون وفيات. ويتحقق ذلك عن طريق إحداث نقص التروية في منطقة الدقاق القاصي قبل زمنيا occludinز الفروع الجانبية المحيطية والطرفية من الشريان المساريقي العلوي لمدة 60 دقيقة باستخدام مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة. ضخه لمدة 1 ساعة، أو 2 ساعة بعد النتائج إصابة في إصابة استنساخه من الأمعاء فحص عن طريق التحليل النسيجي. الموقف الصحيح من لقطات الاوعية الدموية الدقيقة هو أمر حاسم لهذا الإجراء. وبالتالي يوفر مقطع الفيديو المرئي وصف تفصيلي خطوة بخطوة من هذه التقنية. ويمكن استخدام هذا النموذج من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.
Introduction
الأمعاء حساس جدا لانقطاع تدفق الدم الذي يسبب نقص التروية والظهارية الضرر. ضخه بعد نقص التروية توفر إعادة الأوكسجين للأنسجة، ويمكن أن تزيد من تعزيز علم الأمراض. لذلك، يرتبط المعوية إصابة نقص التروية وضخه مع مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك التهاب الأمعاء الناخر، رفض المزروع في زرع الأمعاء الدقيقة، والمضاعفات من البطن جراحة الشريان الأبهر تمدد الأوعية الدموية، المجازة القلبية الرئوية، والتهاب 1،2 أمراض الأمعاء. المعوية الأشعة تحت الحمراء الإصابة، الجلطة المعوية خاصة الحاد، هو حالة تهدد الحياة مما أدى إلى معدلات الاعتلال والوفيات 3.
على الرغم من أن يساء فهمها، ويعتقد الأمعاء نقص التروية ضخه (IR) إصابة تترافق مع تغيرات في مجهريات الأمعاء وكذلك إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية والسيتوكينات الالتهابية وكيموكينات 1،4-6. وهذا يؤدي إلى تنشيط سواء فينيت والآليات المناعية التكيفية التي تعزز الالتهابات والأنسجة إصابة 1،7،8.
النماذج الحيوانية حاسمة لفهم آليات الإصابة الأشعة تحت الحمراء، كما أنها تسمح gain- سهلة والتجارب الجينية الخسارة من وظيفة. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من الأشعة تحت الحمراء التي تشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، وانخفاض التروية التدفق، ومجزأة انسداد الأوعية الدموية (تلخيصها في مراجعة شاملة جرت مؤخرا 9). نقص تروية الأمعاء الناجمة عن انسداد الأوعية الدموية كاملة من الشريان المساريقي (SMA) هو نموذج سهل ويشيع استخدامها من الأشعة تحت الحمراء في الحيوانات الكبيرة والقوارض 9-11. ومع ذلك، ومناطق مختلفة من الأمعاء لها وضعية مختلفة للإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة متنوعة من التخدير، والمسكنات، وتقنيات انسداد الشريان، فضلا عن التضارب في مدة الإصابة الدماغية ونتيجة التعافي في درجات متفاوتة من الإصابة التباس فهمنا للبيولوجيا الأشعة تحت الحمراء عبر الى الدراسات متعددةالصورة. يوضح الجدول 1 هذه التناقضات في دراسات الأشعة تحت الحمراء الفئران. العائق الاكبر من استخدام مرات الدماغية أقصر (30-45 دقيقة) تستهدف نافذة الانتعاش التي تقوم عليها الخلافات تمييز بين الحالات والضوابط يمكن ملاحظتها. إصابة خفيفة لظهارة يمكن حل ساعة بعد ضخه، وبالتالي متخصصة قد تكون هناك حاجة المقاييس المرضية للعثور على الخلافات في الرد الظهارية. في المقابل، الضرر المفرط، كما رأينا من قبل 100 دقيقة من الإصابة الدماغية قد يؤدي إلى denudement كاملة من الظهارة، حيث رد لم يعد ممكنا، وزيادة معدل وفيات، والوقت الانتعاش. ولذلك، ونحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأشعة تحت الحمراء المعوية في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر مجالنا. ويمكن استخدام هذا النموذج من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت الدراسات على الحيوانات وفقا للمعهد الوطني للإرشادات الصحة وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام جنة معهد ترودو. واستخدمت الأسبوع 8-12 القديمة C57BL / 6 الفئران للدراسة.
1. التحضير للجراحة
- إعداد وتعقيم الأدوات الجراحية.
- إعداد نظام التخدير القائم على الأيزوفلورين مع مخروط الأنف، وسادة ساخنة. لا تجعل محموما على يقين سادة ساخنة (<39 درجة مئوية).
- تأكد من أن الأيزوفلورين الكسح الغاز اسطوانة يتم وضع بشكل صحيح لضمان منافذ العادم في الجزء السفلي من العلبة لا يتم حظر أو المغطي بأي شكل من الأشكال. وزن الغاز الكسح العلبة قبل الإجراء والوزن وثيقة على العلبة. تجاهل علبة عندما يتجاوز وزن علبة 50 غ من الوزن المتراكم (~ 12 ساعة).
2. التخدير
- تخدير الفأر مع 3٪ الأيزوفلورين في غرفة الاستقراء (1 لتر / دقيقةO 2).
- تقييم عمق التخدير عن طريق عدم القدرة على البقاء في وضع مستقيم، وفقدان حركة هادفة الطوعية، وفقدان المنعكس طرفة، استرخاء العضلات، وفقدان ردا على ارادي التحفيز (أخمص القدمين أو قرصة الذيل مع الضغط شركة).
- تقييم معدل التنفس ونمط من خلال مراقبة جدار الصدر وحركات البطن. تحت التخدير الأمثل، يجب أن يكون معدل التنفس ~ 55-65 نفسا في الدقيقة.
- إزالة الماوس من غرفة تحريض وبسرعة حلق منطقة البطن من الفأرة.
- لمنع جفاف القرنية، ووضع مرهم للعين لطيف في العينين.
- ضع الماوس على لوحة ساخنة وتوصيله عبر مخروط الأنف لنظام التخدير. يناسب التأكد من اللاتكس الأنف غشاء مخروط بحزم على رأسه من الفأرة وعدم وجود تسرب من الأيزوفلورين.
- تخفيض معدل الأيزوفلورين إلى 1.5٪، وحقن البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) والكيتامين (10 ملغ / كلغ) تحت الجلد لمنع الرياح حتى من الألم تتالي.
- مسح عشرالبريد الجلد من منطقة العملية مع مسحة القطن المعقم غارقة مع الحل الجراحي Betadine تليها 70٪ من الإيثانول.
3. جراحة
- جعل سم البطن خط منتصف 3-5 مع مقص التشغيل. منطقة العملية غطاء مع لوحة العقيمة غير ملتصقة مبللة بمحلول ملحي. عزل الأعور والدقاق وفضح الشريان المساريقي العلوي باستخدام قطعة قطن مبللة في محلول ملحي.
- لتسهيل كليب تطبيق، وجعل النكات صغيرة في مساريق المحيطة الشريان المساريقي العلوي باستخدام القزحية الجميلة scissors.To قيام بذلك، رفع بلطف الأمعاء مع ملقط خلع الملابس وقطع مساريق على كلا الجانبين من الشريان المساريقي العلوي في موقف كليب المطلوب (الشكل 1A). ثم، إضافة بضع قطرات من محلول ملحي معقم إلى منطقة موقف كليب المطلوبة قبل التقدم بطلب لقطات.
ملاحظة: لإجراء الجراحة صورية، اتبع الإجراء الجراحي تصل إلى الخطوة 3.2. لا تنطبق مقاطع. بدلا من ذلك، والحفاظ على الأنسجة الرطبة التي كتبها s دافئ وأضافألين كما هو موضح في 3.6 لمدة 1 ساعة. بعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 4.1، - انسداد الفروع من الدرجة الأولى من الشريان المساريقي العلوي مع لقطات الاوعية الدموية الدقيقة (70 ز قوة) باستخدام مطبق مقطع لإنشاء منطقة 5-7 سم من الدقاق الدماغية المجاور لالأعور (الشكل 1B). على الرغم من أن موقف السفن محافظ، قد تكون هناك اختلافات طفيفة بين الفئران (انظر الأمثلة على الشكل 1). وبالتالي، 2 أو 3 مقاطع وعادة ما تطلب (انظر موقع لقطات على الشكل 1A، D، E، السهام السوداء).
ملاحظة: استخدم مقاطع سفينة ذات جودة عالية. يمكن لقطات ارتفاع ضغط يتلف الاوعية ومنع تجديد في حين مقاطع الضغط المنخفض (<30 ز) قد لا تمنع تماما من تدفق الدم. - منع تدفق الدم ضمانات من خلال الأمعاء باستخدام اثنين من لقطات الاوعية الدموية الدقيقة عبر الأوعية (40 ز قوة)، demarking المنطقة من الأمعاء الدماغية (الشكل 1). مطلوب انسداد الأوعية ضمانات لمنع تدفق الدم من الأوعية الدموية المجاورة (انظر موقع لقطات على الشكل 1A، D، E، السهام الخضراء).
- اختياري: إضافة محلول الهيبارين (6 USP وحدة / مل)، لمنع تخثر الدم. قطرة قطرة إضافة 0.5 مل من محلول الهيبارين إلى الأمعاء المعزولة.
- الرطب معقمة وسادة غير ملتصقة مناديل الحساسة بمحلول ملحي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، وتنطبق على منطقة العمليات الجراحية. تأكد من أن تقضي تبقى رطبة طوال فترة الإجراء.
- الحفاظ على نقص التروية لمدة 60 دقيقة باستخدام التخدير الأيزوفلورين 1-1.5٪ في جميع أنحاء. إذا تم تنفيذ الإجراء نقص التروية بشكل صحيح، فإن المنطقة الدماغية تتغير إلى اللون الأحمر النبيذ في اللون في حوالي 30 دقيقة. لاحظ أن الأوعية الدموية البعيدة إلى موقف كليب تتضخم خلال نقص التروية (الشكل 1، لوحات اليمين) مشيرا إلى انسداد ناجحة.
- تراقب عن كثب الماوس أثناء مرحلة نقص التروية. مواصلة تطبيق محلول ملحي لوحة غير ملتصقة تغطية الموقع لعملية جراحية.
- علامة حواف المنطقة الدماغية قبل pipetting 20 ميكرولتر من Gill`s 3 الهيماتوكسيلين على النسيج لتسهيل حصاد الأنسجة الدماغية والأنسجة السليمة المجاورة من نفس الماوس للمقارنة (الشكل 1E، اللوحة اليمنى).
4. ضخه المرحلة
- في نهاية نقص التروية إضافة بضع قطرات من المياه المالحة في المنطقة كليب وبلطف إزالة مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة مع مقطع مطبق. ثم، ودفع بلطف الأمعاء إلى تجويف البطن باستخدام المياه المالحة مبلل نصائح القطن. إزالة وسادة غير ملتصقة وإغلاق جدار البطن والجلد باستخدام 9 مم الفولاذ المقاوم للصدأ مقاطع الجرح. إذا تم تنفيذ ضخه أطول من 3 ساعات، استخدم خياطة vicryl للامتصاص لإغلاق جدار البطن قبل تطبيق مقاطع الجرح على الجلد.
- الحفاظ على الفئران في قفص نظيفة ساخنة لالمبلغ المطلوب من الوقت (30 دقيقة، 60 دقيقة، 120 دقيقة، أو 180 دقيقة) للمرحلة ضخه.
- تحقق الحيوانات على الأقل كل 30 دقيقة لضمان الاستقرار.
الطبقة = "jove_title"> 5. التشريح وحصاد الأمعاء الدقيقة
- الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 جرعة زائدة تليها خلع عنق الرحم في الوقت المطلوب ضخه التالية.
- فتح تجويف البطن وجمع الأنسجة المعوية الدماغية لمزيد من التحليل. حصاد الأنسجة الطبيعية السليمة المجاورة للأنسجة المصابة باعتبارها الرقابة الداخلية لحساب أي رد فعل النظامية للإصابة.
ملاحظة: هذه السيطرة هو أكثر ملاءمة من الشام تشغيل السيطرة على الفئران لصورية تعمل الفئران لا تخضع رد فعل النظامية الاصابة الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء. - تغسل محتوى الأمعاء باستخدام حقنة 30 مل مع إبرة أنبوب تغذية تعلق مليئة المالحة وثم قطع الأمعاء طوليا. إذا كنت بحاجة لعينة من الأمعاء لتحليل التعبير الجيني، وقطع جزء 1.5 ملم طوليا، واستخدام قطعة المتبقية للتحليل النسيجي.
- للتحليل النسيجي، وإعداد لفافة السويسرية باستخدام زوج من ملقط للفة intestالمعهد الوطني للإحصاء.
- للحفاظ على شكل تدحرجت، ضع قطعة من الأمعاء بين فوم خزعة في أشرطة الأنسجة (الشكل 2). وضع أشرطة في 10٪ مخزنة الفورمالين.
- إصلاح الأنسجة في الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل. استبدال الفورمالين مع الايثانول 70٪ لمدة 24 ساعة إضافية. تخزين الأنسجة في 70٪ من الإيثانول إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
- تضمينها في البارافين، وقطع 5 ميكرون المقاطع وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام بروتوكول قياسي (الشكل 3).
6. تسجيل النقاط
- تسجيل إصابة نقص التروية ضخه الفئران كما تلخيصها في الجدول 2. اختيار طريقة التسجيل المناسب.
- اختياري: تقسيم مجال الرؤية إلى أربعة أقسام منذ شدة الإصابة تختلف في جميع أنحاء القسم.
- حساب متوسط درجات كل قسم من عشرات الحصول عمياء.
- مقارنة درجة من النسيج المصاب بين الحالات والسيطرة وكذلك إلى thلم يصب ه الأنسجة باستخدام اختبار كروسكال واليس، تليها اختبار المقارنات المتعددة لدان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن الأمثل بروتوكول تجريبي لجراحة الأشعة تحت الحمراء للحصول على استنساخه إصابة الأشعة تحت الحمراء التي يسببها للالدقاق في الفئران. وأظهرت نتائج ممثلة في هذا القسم.
ويبين الشكل 1 أمثلة على موقف مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة للحث على نقص التروية من الدقاق. وتشير السهام السوداء موقف مقاطع رئيسية تسد فروع الدرجة الأولى من الشريان المساريقي العلوي. وتشير الأسهم الخضراء موقف مقاطع إضافية لمنع تدفق الدم من الأوعية ضمانات. ملاحظة زيادة حجم السفن المغطي البعيدة لموقف لقطات وتغيير لون المنطقة الدماغية من intestinte. بعد إزالة لقطات في نهاية الأوعية الدموية نقص التروية استعادة تدفق الدم والعودة الى حجمه الطبيعي.
ويبين الشكل 2 مثالا على كاسيت الأنسجة التي تحتوي على لفائف السويسرية أعدت من يخدعمكافحة األمراض والمناطق الدماغية من الدقاق بعد 1 ساعة من نقص التروية، تليها ساعة 1 من ضخه. وأدرج قطعة من الطحال لتسهيل تحديد المواقع من السيطرة والأشعة تحت الحمراء الأمعاء أثناء معالجة وتلطيخ. لاحظ الفرق بين لون السيطرة والأنسجة الدماغية.
ويبين الشكل 3 ممثل الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ عن نطاق السيطرة والمناطق الدماغية من الدقاق بعد 1 ساعة من نقص التروية، أو 1 ساعة من نقص التروية تليها ساعة 2 من ضخه. ملاحظة الضرر الشديد للظهارة بعد 1 ساعة من نقص التروية تتميز الزغب النزفية، ظهارة denudement مع جزئية لاستكمال الاجتثاث من الأقبية، وتسلل الخلايا المناعية (النجمة). بعد ساعة 2 من الضرر ضخه الزغب والتهاب تستمر (النجمة)، ولكن ليس هناك نزيف الأنسجة.
ويبين الشكل 4 مثال لتحليل قبرصي التهاباتالتعبير tokines في 1 ساعة و 2 ساعة بعد نقص التروية ضخه في الأمعاء الإقفاري والسيطرة. ملاحظة upregulation من التعبير مرنا من TNF، IL-1B، IL-6 و CXCL2 في 1 ساعة و 2 ساعة بعد نقص التروية ضخه مقارنة للسيطرة على الأنسجة السليمة.
الشكل 1: تحريض نقص التروية باستخدام كليب الأوعية الدموية (A) منطقة معزولة من الأمعاء تحتوي على الأعور والدقاق. مصنوعة الجروح الصغيرة في مساريق المحيطة الشريان المساريقي العلوي لتسهيل تطبيق كليب. (ب) الاوعية الدموية الدقيقة كليب التطبيق باستخدام مقطع مطبق. (C) الموقع من مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة في الشريان المساريقي العلوي للحث على نقص التروية. (D، E). أمثلة على بنية الأوعية الدموية وكليب المواقع في الفئران مختلفة. تشير الأسهم في المنطقة الدماغية من الدقاق تميزت الهيماتوكسيلين. <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:.. تحضير الأنسجة للتحليل النسيجي كاسيت الأنسجة التي تحتوي على لفائف السويسرية أعدت من المناطق الدماغية والسيطرة على الدقاق بعد 1 ساعة من نقص التروية تليها ساعة 1 من ضخه الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ من الدقاق بعد نقص التروية الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ عن نطاق السيطرة والدماغية مناطق الدقاق بعد 1 ساعة من نقص التروية، أو 1 ساعة من نقص التروية. تليها في الساعة 2 من ضخه. قضبان = 500 ميكرون (لوحات أعلى)، 200 ميكرون (لوحات أسفل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعبير عن التهابات السيتوكينات خلال الإسكيمية-ضخه التعبير عن CXCL2، TNF، IL-6، وقد تم قياس IL-1B في 1 ساعة و 2 ساعة بعد نقص التروية ضخه في الأنسجة الدماغية (IR) والأنسجة الضابطة (C). المتاخمة للمنطقة الدماغية التي كتبها الوقت الحقيقي PCR. ن = 3-8 الفئران في كل مجموعة، * ف <0.05. ** ف <0.01. *** ع <0.001. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أنواع الفئران | التخدير / تسكين | الشريان طريقة الانسداد | الوقت نقص التروية | الوقت بعد ضخه | مرجع | |||
| الفئران سبراغ داولي | بنتوباربيتال الصوديوم | انسداد SMA والشريان البطني باستخدام كليب تمدد الأوعية الدموية أو المشبك | 45 دقيقة | 2 ساعة | 12 | |||
| C57Bl6 / 129 | 2٪ الهالوثان | انسداد الشريان المساريقي، والقريبة والبعيدة أجزاء من الأنسجة الدماغية. | 30-130 دقيقة | 6 ساعة | 13 | |||
| C57BL / 6 | الكيتامين، الأيزوفلورين | انسداد SMA باستخدام مقاطع تمدد الأوعية الدموية. انسداد circul جانبيةأوجه في القريبة والمناطق البعيدة. | 1 ساعة | 1.5 ساعة | 4،8،11 | |||
| C3H / HEJ | بنتوباربيتال الصوديوم | انسداد باستخدام مشبك تمدد الأوعية الدموية أو المشبك | 40 دقيقة | 6 ساعة | 14 | |||
| C56BL / 6 | الأيزوفلورين | انسداد الشريان SMA واللفائفي القولوني باستخدام مشبك تمدد الأوعية الدموية أو المشبك | 100 دقيقة | 1، 2، 4، 24 ساعة | 15 | |||
| C57BL / 6 | يوريتان | انسداد باستخدام مشبك تمدد الأوعية الدموية أو المشبك | 45 دقيقة | 60 دقيقة | 16 | |||
الجدول 1: التغيرات في منهجية في الإصابات الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء الفئران المعوية
| نظام الأنسجة التهديف | مرجع | ||
| الصف 0: الغشاء المخاطي عادي | 13،17،18 | ||
| الصف 1: الفضاء تحت الظهارة في الطرف الزغابي | |||
| الصف 2: الفضاء تحت الظهارة أكثر الموسعة | |||
| الصف 3: رفع طلائي على طول الجانبين زغبي | |||
| الصف 4: الجرداء الزغب | |||
| الصف 5: فقدان الأنسجة زغبي | |||
| الصف 6: سرداب طبقة احتشاء | |||
| الصف 7: احتشاء Transmucosal | |||
| الصف 8: احتشاء بطريق | |||
| الصف 0: الغشاء المخاطي عادي | 4،8،11،19-21 | ||
| الصف 1: النزع من الخلايا على نصائح زغبي | |||
| كانت الزوائد غائبا، ولكن كانت أقبية لا يزال يمكن اكتشافها بسهولة: الصف 3 | |||
| الصف 4: غياب تام للهياكل الظهارية ونخر بطريق | |||
| الصف 0: زغابة عادي | 6،22-31 | ||
| الصف 1: الزوائد مع تشويه طرف | |||
| الصف 2: خلايا القدح والمساحات Gugenheims "مفقودة | |||
| الصف 3: الزوائد مع اضطراب غير مكتمل من الخلايا الظهارية | |||
| الصف 4: الزوائد مع المكشوفة، ولكن سليمة الصفيحة المخصوصة مع النزع الخلايا الظهارية | |||
| الصف 5: الصفيحة المخصوصة والنضوح | |||
| الصف 6: الزوائد أن عرض نزيف أو الزغب التي يتم الجرداء | |||
| الصف 0: الأنسجة العادية 32،33 | |||
| الصف 1: اضطراب طفيف من ظهارة السطح | |||
| الصف 2: الظهارية إصابة فقدان الخلية في طرف زغابة | |||
| الصف 3: vasocongestion المخاطية، والنزف، ونخر بؤري مع فقدان أقل من نصف الزغب | |||
| الصف 4: الضرر يمتد إلى أكثر من نصف من الزغب | |||
الجدول 2: علم الأنسجة أنظمة التهديف في الإصابات الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء الفئران المعوية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطوير نماذج الماوس الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية قد تحسنت بشكل كبير في فهم آليات إصابة الأنسجة وساعد في تطوير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للحد من تلف الأنسجة 7،9،11،34. الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي تحديد المواقع المناسبة لقطات الاوعية الدموية الدقيقة، والتوقيت الصحيح لتقييم نقص التروية ونسيجية السليمة للإصابة الأشعة تحت الحمراء.
مدة التروية هو أمر حاسم لأضرار الظهارية لاحق. الوقت النموذجي المطلوبة للحث على إصابة الأشعة تحت الحمراء استنساخه دون معدلات الاعتلال والوفيات من فئران التجارب هو 45-60 دقيقة تليها ضخه 2-3 ساعة. فترات طويلة من نقص التروية قد يؤدي إلى فقدان كامل للظهارة وزيادة معدل الوفيات. على سبيل المثال، في نموذج الخنازير من نقص التروية صائمية، أدى 60 دقيقة انسداد في فقدان جزئي للظهارة فيلا، في حين أدى انسداد لمدة 120 دقيقة إلى فقدان كامل للزغابة ظهارة 35. أناmportantly، قد يعرض خالية من الجراثيم والفئران التلاعب بها وراثيا زيادة الحساسية للإصابة الأشعة تحت الحمراء، ووقت وبالتالي الأمثل لنقص التروية وضخه قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل في التجارب الأولية. على الرغم من أن الوقت النموذجي لتقييم تلف الأنسجة بعد ضخه 2-3 ساعة، والوقت الطويل (12 ساعة) مطلوب لتحليل الجذعية الأمعاء تعبئة خلية 36. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للتغيرات في الجراثيم المتعايشة وTLR / بوساطة نود الإشارة تؤثر بشكل كبير نتيجة للإصابة الأشعة تحت الحمراء 4،8،37-39.
الموقف الصحيح من لقطات الاوعية الدموية الدقيقة هو أمر حاسم لإصابة الأشعة تحت الحمراء استنساخه أيضا. نحن هنا وصف لنموذج إصابة الأشعة تحت الحمراء للالدقاق القاصي الفئران. ومن المعروف الاجزاء البارزة من الأمعاء وعرض حساسية مختلفة لإصابة الأشعة تحت الحمراء. على سبيل المثال، الصائم هو أكثر حساسية للإصابة الأشعة تحت الحمراء من الدقاق والقولون 9،34،40. في الواقع، نموذج نقص التروية ضخه من الصائم قبل الاغلاق SMA مع واحديستخدم كليب عادة لدراسة آليات إصابة الأشعة تحت الحمراء (انظر المرجع. (9) لإجراء مراجعة شاملة لأساليب مختلفة من الأشعة تحت الحمراء إصابة في الحيوانات). ومع ذلك، فإن الموضع الدقيق للكليب وتحليل أجزاء مختلفة من الأمعاء، فضلا عن أساليب مختلفة من التخدير يختلف بين هذه الدراسات، مما يجعل من الصعب على الإنجاب (انظر الجدول 1). تعقيد إضافي من الإصابة الأشعة تحت الحمراء من الصائم هو ارتفاع معدل الوفيات منذ وضع مقطع الأوعية الدموية وثيق إلى جذر SMA يؤثر على تدفق الدم إلى منطقة واسعة من الأمعاء. لذلك، في الدراسة الحالية قمنا بتطوير بروتوكول للحث على إصابة الأشعة تحت الحمراء متسقة من محطة الدقاق، والتي من السهل على الإنجاب. للحث على إصابة الأشعة تحت الحمراء استنساخه من الدقاق، الموقف الصحيح من لقطات الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية. ويتحقق ذلك عن طريق تسد الفروع الطرفية والجانبية من المساريقي العلوي من درجة artery.The الإصابة الأشعة تحت الحمراء يمكن تقييمها من قبل تقييم الهيماتوكسيلين ويوزين المقاطع باستخدام الأصلي تشيو / الاسميةك أو أنظمة النتيجة المعدلة 11،18،34،41،42. بالإضافة إلى ذلك، وتقييم تلف الأنسجة يمكن القيام بها باستخدام محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز البيوتين dUTP نيك نهاية العنونة (النفق) تلطيخ من الحمض النووي مجزأة، أو نشاطا كاسباس 3 تلطيخ المناعى، وتحليل العدلات من خلال قياس النشاط الميلوبيروكسيديز أو تقييم المناعى من العدلات باستخدام غرام -1، أو Ly6G الأجسام المضادة تلطيخ 7،11. السيتوكينات و chemokines التهابات، مثل IL-1B، TNF، IL-6، CXCL1، CXCL2، CCL2 يمكن تقييمها من قبل في الوقت الحقيقي PCR 2،4،8. ويرد مثال لتحليل التعبير خلوى التهابات في الشكل (4).
ومن المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من استنساخ عالية وسهولة الوصول إليها من إصابة الأشعة تحت الحمراء للالدقاق، وهذا النموذج قد لا تعكس جميع علامات سريرية من الأمراض التي تصيب البشر، في الحالات المرضية المزمنة وخاصة والشروط مع انسداد جزئي للالمساريقي الشريان متفوقة 9 9،43. لذلك، ويجري حاليا وضع نماذج باستخدام الحيوانات الكبيرة، مثل الخنازير 9،44. الاختيار الدقيق للنموذج حيواني تبعا لحالة الإنسان التي تجري دراستها أمر بالغ الأهمية. باختصار، نحن تصف نموذج سهل وقوي للإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية التي يمكن استخدامها لدراسة آلية الخلوية والجزيئية الإصابة الظهارية والتجدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وبدعم من مؤسسة العلوم الروسية هذا العمل، منح لا. 14-50-00060 وLLC RUSCHEMBIO. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة Crohn`s والتهاب القولون الأمريكية منح 294083 (لAVT)، والمعاهد الوطنية للصحة منح RO1 DK47700 (إلى CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
