Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L'augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Le Acyrthosiphon pisum du puceron, avec un génome séquencé et la plasticité phénotypique abondante, est devenue un modèle émergent des études de génomique et de développement. Comme d'autres pucerons, A. Pisum propager rapidement par reproduction vivipare parthénogénétique, où les embryons se développent dans des chambres d'œufs dans une chaîne de montage dans le ovariole. Auparavant, nous avons établi une plate-forme robuste de l'ensemble de montage hybridation in situ permettant la détection de l'expression des ARNm dans les embryons de pucerons. Pour l'analyse de l'expression de la protéine, cependant, les protocoles établis pour immunocoloration les ovarioles de pucerons vivipares asexués n'a pas produit de résultats satisfaisants. Nous rapportons ici des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond, qui étaient tous deux des problèmes lors de l'application des approches établies. Optimisations incluent: (1) l'incubation de la protéinase K (1 pg / ml, 10 min), qui a été trouvé f essentielleou la pénétration d'anticorps dans les embryons à moyen et pucerons en fin de ligne; (2) le remplacement de sérum-albumine de sérum de chèvre / bovin normal avec un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) à base de jeu de tampons et (3) l'application de méthanol au lieu du peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2)} pour le blanchiment de peroxydase endogène; qui réduit de manière significative le bruit de fond dans les tissus de pucerons. Ces conditions critiques optimisés pour un marquage permettra une détection efficace des produits de gènes dans les embryons de A. Pisum et autres pucerons.

Introduction

Les pucerons sont des insectes hémiptères avec des petits (1-10 mm) corps mous. Ils se nourrissent de plantes en suçant la sève de phloème pièces buccales perçants. En outre, ils comptent sur ​​une bactérie endosymbiotique obligatoire, Buchnera aphidicola, pour synthétiser des acides aminés essentiels qui sont déficients dans le régime alimentaire de la sève du phloème. Les pucerons ont une histoire de vie complexe qui comprend la reproduction vivipare parthénogénétique au printemps et en photopériode longue journée d'été et la reproduction ovipare sexuelle déclenchée par une photopériode de jours courts pendant laquelle ils pondent un nombre limité de ^1,2 œufs d'hiver. Au printemps ces œufs éclosent pour produire la première génération de toutes les femelles fondatrices (pucerons), à la suite de nombreux cycles de reproduction parthénogénétique jusqu'à l'automne. La parthénogenèse cyclique chez les pucerons, où les phases sexuée et asexuée alternent dans le cycle de vie annuel, a été considéré comme une nouveauté ^1,2 évolutif. Dans les pucerons vivipares parthé, L'embryogenèse a lieu dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles). En revanche, les embryons ovipares sexuels se développent dans les œufs fécondés. En dehors de la plasticité de la reproduction, les pucerons peuvent afficher polyphénisme aile transgénérationnel: en réponse aux signaux de la surpopulation et des menaces de prédateurs, les femelles asexuées sans ailes peuvent vivipares produire une descendance ailée pour la migration à longue distance. Publication de la séquence du génome du puceron du pois Acyrthosiphon pisum -la première séquence du génome d'une base insectes permet hémimétaboles poursuite de l'exploration de la plasticité de la reproduction, polyphénisme de l'aile, et d'autres fonctionnalités, y compris les interactions insectes-plantes, vectorisation virale et la symbiose de pucerons sur une moléculaire base ^3.

En plus de la séquence du génome, les outils permettant de caractériser la fonction des gènes et l'expression sont nécessaires pour promouvoir le puceron du pois comme un organisme modèle mûre ^4. Nous avons décrit les protocoles robustes de l'ensemble de montage <em> hybridation in situ pour détecter l'expression de l'ARNm dans les embryons de pucerons ^5-7. L'interférence ARN (ARNi) par injection d'ARN double brin et de l'alimentation a été utilisée pour le silençage génique dans nymphes de pucerons et les adultes, mais des conditions stables pour knockdown gène dans les embryons ont pas encore été signalé ^8-10. Immunocoloration, une approche basée sur les anticorps qui peuvent détecter l'expression de la protéine dans des échantillons avant et après knockdown ARNi, a été réalisée sur les embryons du puceron du pois ^11-13. Cependant, l'augmentation de la perméabilité des tissus et l'élimination de la coloration de fond sont encore insatisfaisants utilisant des protocoles standards pour immunocoloration dans les embryons asexués vivipares du puceron du pois. Par exemple, nous avons trouvé que la pénétration des anticorps dans les tissus a diminué chez les embryons gastrulating (étapes 8 à 10) et que les embryons avec bourgeons des membres morphologiquement identifiables (étapes 13-14) ont été à peine perméable à l'anticorps. En outre, la coloration de fond a été visualisée dans le vivíparo asexuéenous pois embryons de pucerons colorées utilisant un anticorps contre le marqueur de la lignée germinale Vasa ainsi que celle contre la protéine Engrailed / invected exprimé dans les segments embryonnaires ^12,13. En fait, la coloration de fond était encore bien visible dans les embryons colorées avec l'anticorps secondaire seul.

Afin d'augmenter la perméabilité sans endommager l'intégrité des tissus de pucerons, nous augmentée avec précaution la concentration de protéinase K et déterminé les conditions optimales pour la digestion du tissu sur les embryons de pucerons. Afin d'éviter la coloration non-spécifique dans le puceron du pois, nous avons cherché des composés qui pourraient bloquer efficacement les embryons et supprimer l'activité de peroxydase endogène (POD), une enzyme utilisée pour amplifier des signaux pendant immunocoloration. Un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) jeu de tampons à base plutôt le sérum de chèvre normal traditionnellement utilisé (NGS) / sérum albumine bovine (BSA), réduit de façon significative la coloration de fond. En outre, le methanol a été trouvé à INHIbit l'activité de POD endogène plus efficace que le peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2).} Les détails concernant ces conditions spécifiques pucerons pour un marquage sur les embryons seront décrits dans les sections suivantes.

Protocol

1. Culture de pucerons NOTE:. La souche de laboratoire de l'parthénogénétique vivipare puceron du pois A pisum été initialement collectées dans le centre de Taiwan et a été élevé sur les plantes hôtes (le sativum jardin pois Pisum ou la fève Vicia faba) sous photopériode de jours longs pour plus de 300 générations (une génération: ~ 10 jours). Germination des graines Faire tremper les graines de plantes hôtes dans l'eau du…

Representative Results

Dans cette étude, nous avons effectué tout le montage immunocoloration sur des embryons de pucerons du pois asexuées (figure 1A). Ces femelles produisent progéniture par parthénogenèse et vivipares. Ces embryons femelles se développent dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles) (figure 1B et figure 2A). Avant la microscopie, les ovarioles disséqués sont les cibles de coloration; Toutefois, la séparation d…

Discussion

Nous avons identifié des conditions optimales critiques immunocoloration succès dans le puceron du pois A. Pisum, un organisme modèle émergent des études de génomique et de développement ^3,15. Des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité du tissu et réduire la coloration de fond amélioré l'intensité et la spécificité des signaux. Ils diffèrent des protocoles standard pour immunocoloration dans d'autres modèles animaux dans les étapes de création de por…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.