Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Die Erbsenblattlaus Erbsenlaus, mit einem sequenzierten Genoms und reichlich phänotypische Plastizität, hat sich zu einem aufstrebenden Modell für genomische und Entwicklungsstudien. Wie andere Blattläuse, A. Pisum ausbreiten schnell über parthenogenetic viviparous Vervielfältigung, in denen die Embryonen im Ei Kammern in einem Fließband in der Ovariole. Bisher haben wir eine robuste Plattform von ganzen-mount in situ Hybridisierung ermöglicht Detektion von mRNA-Expression in den Blattlaus Embryonen etabliert. Zur Analyse der Expression von Protein, obwohl, etablierten Protokolle für die Immunfärbung der Ovariolen der asexuellen viviparous Blattläuse nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Verringern der Hintergrundfärbung, die beide Probleme bei der Anwendung von etablierten Ansätzen optimiert berichten wir hier. Optimierungen umfassen: (1) Inkubation mit Proteinase K (1 ug / ml, 10 min), die wesentlich f gefunden wurdeoder Antikörper-Penetration in mittleren und späten Stadium Blattlaus Embryonen; (2) Austausch von normalem Ziegenserum / Rinderserumalbumin mit einem Blockierungsreagenz durch eine Digoxigenin (DIG) geliefert -basierte Puffer gesetzt und (3) Anwendung von Methanol statt Wasserstoffperoxid (H _{2 O 2)} zum Bleichen von endogenen Peroxidase; welche deutlich reduziert die Hintergrundfärbung in der Blattlaus Gewebe. Diese kritischen Bedingungen für die Immunfärbung optimiert werden effektive Erkennung von Genprodukten in den Embryonen von A. Pisum und andere Blattläuse zu ermöglichen.

Introduction

Blattläuse sind hemipteran Insekten mit kleinen (1-10 mm) weichen Körper. Sie ernähren sich von Pflanzen durch das Saugen Phloemsaft mit stechenden Mundwerkzeuge. Darüber hinaus setzen sie auf eine obligate Endosymbionten Bakterium, Buchnera aphidicola, um essentiellen Aminosäuren, die einen Mangel an der Phloemsaft Ernährung sind zu synthetisieren. Blattläuse haben einen komplexen Lebensgeschichte, die parthenogenetic viviparous Reproduktion im Frühjahr und Sommer Langtagsphotoperioden und sexuelle oviparous Wiedergabe durch Kurztagsphotoperioden, in denen sie eine begrenzte Anzahl von überwinternden Eiern ^1,2 lag ausgelöst umfasst. Im Frühjahr diesen Eiern schlüpfen, um die erste Generation der rein weiblichen Blattläusen (fundatrices) zu produzieren, nach vielen Runden parthenogenetic Wiedergabe bis in den Herbst. Die zyklische Parthenogenese in Blattläuse, wo asexuelle und sexuelle Phasen wechseln im jährlichen Lebenszyklus hat sich als eine evolutionäre Neuheit ^1,2 angesehen. In den parthenogenetic viviparous BlattläuseNimmt der Embryogenese innerhalb Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen). Im Gegensatz dazu entwickeln sexuelle oviparous Embryonen in die befruchtete Eier. Abgesehen von der reproduktiven Plastizität kann Blattläuse transgeneFlügel polyphenism Anzeigen: als Antwort auf Überbelegung Signale und Raubtier-Bedrohungen können die unwinged asexuelle Weibchen lebendgebärender produzieren geflügelten Nachkommen für Langstreckenwanderung. Veröffentlichung der Genomsequenz des Erbsenblattlaus Erbsenlaus -die erste Genomsequenz für eine basale hemimetabolous insekten ermöglicht die weitere Erforschung der reproduktiven Plastizität Flügel polyphenism und weitere Funktionen, darunter Insekten-Pflanzen-Interaktionen, virale Vectoring und Symbiose in Blattläuse auf molekularer Basis ^3.

Zusätzlich zu dem sequenzierten Genoms werden Werkzeuge zum Charakterisieren Genexpression und die Funktion zur Förderung der Erbsenblattlaus als reife Modellorganismus ⁴ erforderlich. Wir haben robuste Protokolle der ganzen-mount beschrieben <em> in situ-Hybridisierung zum Nachweis der Expression von mRNA in Blattlaus Embryonen ^5-7. RNA-Interferenz (RNAi) durch doppelsträngige RNA-Injektion und Fütterung für Gen-Silencing in Blattlaus Nymphen und Erwachsene verwendet worden, aber stabilen Bedingungen für die Gen in den Embryonen Knockdown noch nicht gemeldet ^8-10. Immunfärbung, ein Antikörper-basierten Ansatz, der Protein-Expression in Proben nachweisen kann vor und nach RNAi hat auf Erbsenblattlaus Embryonen ^11-13 durchgeführt. , Erhöhung der Gewebe Durchlässigkeit und Eliminierung von Hintergrundfärbung sind jedoch noch nicht zufriedenstellend Verwendung von Standardprotokollen für die Immunfärbung in der asexuellen viviparous Embryonen von Erbsenblattlaus. Beispielsweise fanden wir, dass das Eindringen von Antikörper zu den Geweben verringert in gastrulating Embryonen (Stufen 8-10), und dass Embryonen morphologisch identifizierbaren Extremitätenknospen (Stufen 13-14) waren kaum durchlässig für Antikörper. Darüber hinaus wurde die Hintergrundfärbung in der ungeschlechtlichen viviparo visualisiertus Erbsenblattlaus Embryonen färbt unter Verwendung von Antikörper gegen die Keimbahn Marker Vasa als auch die gegen das Engrailed / Invected Protein in den embryonalen Segmente ^12,13 ausgedrückt. Tatsächlich Hintergrundfärbung noch in Embryonen mit dem sekundären Antikörper allein gefärbt deutlich sichtbar.

Um die Durchlässigkeit ohne Beschädigung Integrität Blattlaus Geweben erhöhen wir sorgfältig titriert die Konzentration von Proteinase K und bestimmt optimale Bedingungen für die Gewebeverdauungs auf Blattläuse Embryonen. Um nicht-spezifische Färbung in der Erbsenblattlaus zu vermeiden, suchten wir nach Verbindungen, die effektiv blockieren könnten Embryonen und zu unterdrücken Aktivität von endogenen Peroxidase (POD), ein Enzym zur Verstärkung von Signalen während der Immunfärbung eingesetzt. Ein Blockierungsmittel durch eine Digoxigenin (DIG) basierende Puffersatz vorgesehen ist, sondern die traditionell verwendet normalem Ziegenserum (NGS) / Rinderserumalbumin (BSA), deutlich reduziert Hintergrundfärbung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Methanol InHiBit des endogenen POD-Aktivität wirksamer als Wasserstoffperoxid (H _{2 O 2).} Einzelheiten bezüglich dieser Blattlaus-spezifischen Bedingungen für die Immunfärbung an Embryonen wird in den folgenden Abschnitten beschrieben werden.

Protocol

1. Kultur der Blattläuse . HINWEIS: Der Laborstamm des parthenogenetic viviparous Erbsenblattlaus A pisum wurde ursprünglich in der Zentral-Taiwan gesammelt und hat sich auf Wirtspflanzen (der Gartenerbse Pisum sativum oder Saubohne Vicia faba) unter Langtagsphotoperiode für mehr als 300 Generationen erzogen worden (einer Generation: ~ 10 Tage). Keimung von Samen Weichen Sie die Samen der Wirtspflanzen in Leitungswasser für 3-5 Tage bei RT. Nachfüllen …

Representative Results

In dieser Studie, führten wir ganze-mount Immunfärbung an Embryonen der asexuellen Erbsen Blattläuse (Abbildung 1A). Diese weibliche Nachkommen zu produzieren parthenogenetisch und lebendgebärender. Diese weibliche Embryonen im Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen) (Abbildung 1B und 2A). Vor der Mikroskopie, die seziert Ovariolen sind die Färbung Ziele; jedoch wird die Trennung Eikammern zur Beobachtung von Embryonen unter ein…

Discussion

Wir identifizierten optimalen Bedingungen für eine erfolgreiche Immunfärbung in der Erbsenblattlaus A. Pisum, ein aufstrebendes Modellorganismus für genomische und Entwicklungsstudien ^3,15. Optimierten Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Reduzieren der Hintergrundfärbung verstärkt die Intensität und Spezifität von Signalen. Sie unterscheiden sich von Standardprotokollen für die Immunfärbung in anderen Tiermodellen in den Schritten zum Erzeugen von Poren in Ze…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.