मटर Aphid भ्रूण में immunostaining के लिए गंभीर स्थिति की पहचान: ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और पृष्ठभूमि धुंधला घटाना
Summary
A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.
Abstract
मटर एफिड Acyrthosiphon पाइसम, एक अनुक्रम जीनोम और प्रचुर मात्रा में प्ररूपी प्लास्टिसिटी साथ जीनोमिक और विकास अध्ययन के लिए एक उभरती हुई मॉडल बन गया है। अन्य एफिड, एक तरह। पाइसम भ्रूण ovariole में एक विधानसभा लाइन फैशन में अंडा कक्षों के भीतर विकसित जहां स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली प्रजनन, के माध्यम से तेजी से प्रचार। पहले हम एफिड भ्रूण में mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अनुमति देता है स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट की एक मजबूत मंच की स्थापना की है। प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, हालांकि, संतोषजनक परिणाम नहीं मिला अलैंगिक जीवित बच्चा जनने वाली एफिड की ovarioles immunostaining के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की। यहाँ हम ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और स्थापित दृष्टिकोण को लागू करने जब समस्याओं थे, जो दोनों की पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना, कम करने के लिए अनुकूलित शर्तों की रिपोर्ट। अनुकूलन शामिल हैं: आवश्यक च पाया गया था जो proteinase कश्मीर (1 माइक्रोग्राम / एमएल, 10 मिनट), (1) के ऊष्मायनमध्य और देर चरण एफिड भ्रूण में या एंटीबॉडी पैठ; एक digoxigenin (डीआईजी) द्वारा आपूर्ति की एक अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ सामान्य बकरी सीरम / गोजातीय सीरम albumin (2) के प्रतिस्थापन सेट बफर और अंतर्जात peroxidase विरंजन के लिए मेथनॉल बल्कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2) (3) आवेदन आधारित; जो काफी एफिड ऊतकों में पृष्ठभूमि धुंधला कम कर दिया। Immunostaining के लिए अनुकूलित ये गंभीर स्थिति एक। पाइसम और अन्य एफिड के भ्रूण में जीन उत्पादों की प्रभावी पता लगाने की अनुमति होगी।
Introduction
एफिड छोटे (1-10 मिमी) मुलायम निकायों के साथ hemipteran कीड़े हैं। वे भेदी mouthparts साथ फ्लोएम एसएपी चूसने से पौधों को खाते हैं। इसके अतिरिक्त, वे फ्लोएम एसएपी आहार में कमी कर रहे हैं कि आवश्यक अमीनो एसिड के संश्लेषण के लिए, एक लाचार एंडोसिम्बायोटक जीवाणु, Buchnera aphidicola पर भरोसा करते हैं। एफिड वसंत और गर्मियों लंबे दिन Photoperiods और वे overwintering अंडे 1,2 की एक सीमित संख्या में रखना है, जिसके दौरान कम दिन Photoperiods से चालू होने वाले यौन अंडोत्पन्न प्रजनन के दौरान स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली प्रजनन भी शामिल है कि एक जटिल जीवन का इतिहास है। वसंत ऋतु में इन अंडों से शरद ऋतु तक स्वजात प्रजनन के कई दौर के बाद, सभी महिला एफिड (fundatrices) की पहली पीढ़ी का निर्माण करने के हैच। वार्षिक जीवन चक्र में अलैंगिक और यौन चरणों वैकल्पिक, एक विकासवादी नवीनता 1,2 के रूप में माना गया है, जहां एफिड, में चक्रीय अनिषेकजनन। स्वजात जीवित बच्चा जनने वाली एफिड में, भ्रूण डिम्बग्रंथि नलिकाओं (ovarioles) का अंडा कक्षों के भीतर जगह लेता है। इसके विपरीत, यौन अंडोत्पन्न भ्रूण निषेचित अंडे में विकसित करना। इसके अलावा प्रजनन प्लास्टिसिटी से, एफिड transgenerational विंग polyphenism प्रदर्शित कर सकते हैं: भीड़भाड़ संकेतों और शिकारी की धमकी के जवाब में, unwinged अलैंगिक महिलाओं viviparously लंबी दूरी माइग्रेशन के लिए पंखों वाला वंश का उत्पादन कर सकते हैं। मटर एफिड के जीनोम अनुक्रम का प्रकाशन Acyrthosiphon पाइसम -इस के लिए पहला जीनोम अनुक्रम एक बेसल hemimetabolous कीट-अनुमति देता है प्रजनन प्लास्टिसिटी, विंग polyphenism, और एक आणविक पर एफिड में कीट-संयंत्र बातचीत, वायरल vectoring और सहजीवन सहित अन्य सुविधाओं की आगे की खोज आधार 3।
अनुक्रम जीनोम के अलावा, जीन अभिव्यक्ति और समारोह निस्र्पक के लिए उपकरण एक परिपक्व मॉडल जीव के रूप में 4 मटर एफिड को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक हैं। हम पूरे माउंट की मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है <em> एफिड भ्रूण 5-7 में mRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण में। डबल असहाय आरएनए इंजेक्शन और खिलाने के माध्यम से शाही सेना के हस्तक्षेप (आरएनएआई) एफिड देवियां और वयस्कों में जीन मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन भ्रूण में पछाड़ना जीन के लिए स्थिर की स्थिति अभी तक 8-10 सूचना नहीं किया गया है। Immunostaining, और आरएनएआई पछाड़ना के बाद, मटर एफिड भ्रूण 11-13 पर प्रदर्शन किया गया है पहले नमूने में प्रोटीन अभिव्यक्ति पता लगा सकते हैं कि एक एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण। हालांकि, ऊतक पारगम्यता और पृष्ठभूमि धुंधला के उन्मूलन की वृद्धि मटर एफिड की अलैंगिक जीवित बच्चा जनने वाली भ्रूण में immunostaining के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग के रूप में अभी तक असंतोषजनक हैं। उदाहरण के लिए, हम ऊतकों को एंटीबॉडी की कि प्रवेश gastrulating भ्रूण में कमी आई पाया (8-10 चरणों) और आकृति विज्ञान से पहचाने जाने अंग कलियों (चरणों 13-14) के साथ भ्रूण एंटीबॉडी के लिए मुश्किल से पारगम्य थे। इसके अलावा, पृष्ठभूमि धुंधला अलैंगिक viviparo में कल्पना की गई थीgermline मार्कर वासा के साथ-साथ उस के खिलाफ भ्रूण खंडों 12,13 में व्यक्त Engrailed / Invected प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग दाग हमें मटर एफिड भ्रूण। असल पृष्ठभूमि धुंधला अभी भी अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग भ्रूण में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था।
एफिड ऊतकों की अखंडता को नुकसान पहुँचाए बिना पारगम्यता बढ़ाने के क्रम में, हम ध्यान proteinase कश्मीर की एकाग्रता titrated और एफिड भ्रूण पर ऊतक पाचन के लिए इष्टतम स्थितियों चुना गया। मटर एफिड में गैर विशिष्ट धुंधला से बचने के क्रम में, हम प्रभावी रूप से भ्रूण ब्लॉक और अंतर्जात peroxidase (पॉड) की गतिविधि, immunostaining के दौरान संकेतों amplifying के लिए कार्यरत एक एंजाइम को दबा सकता है कि यौगिकों के लिए खोज की। पारंपरिक रूप से इस्तेमाल सामान्य बकरी सीरम बल्कि (NGS), एक digoxigenin (डीआईजी) आधारित बफर सेट द्वारा उपलब्ध कराए गए एक अवरुद्ध अभिकर्मक / गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), काफी पृष्ठभूमि धुंधला कम कर दिया। इसके अलावा, मेथनॉल inhi पाया गयाहाइड्रोजन पेरोक्साइड से अधिक प्रभावी ढंग से अंतर्जात पॉड गतिविधि बिट (एच 2 ओ 2)। भ्रूण पर immunostaining के लिए इन एफिड-विशिष्ट परिस्थितियों के बारे में विवरण निम्न वर्गों में वर्णित किया जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम मटर एफिड ए में सफल immunostaining के लिए महत्वपूर्ण इष्टतम स्थितियों की पहचान की। पाइसम, जीनोमिक और विकास अध्ययन 3,15 के लिए एक उभरती हुई मॉडल जीव। ऊतक पारगम्यता बढ़ाने और पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).
Materials
| 30% hydrogen perxidase (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 1.1586E+10 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
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