Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l'aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Il Acyrthosiphon pisum pisello afide, con un genoma sequenziato e abbondante plasticità fenotipica, è diventata un modello emergente per studi di genomica e di sviluppo. Come altri afidi, Un. Pisum propagarsi rapidamente tramite riproduzione vivipara partenogenetica, dove gli embrioni si sviluppano all'interno di camere d'uovo in maniera catena di montaggio nel ovariole. In precedenza abbiamo stabilito una solida piattaforma di tutto il montaggio ibridazione in situ che consente il rilevamento di espressione di mRNA negli embrioni afidi. Per analizzare l'espressione della proteina, però, i protocolli stabiliti per immunocolorazione i ovarioli di afidi vivipari asessuati non ha prodotto risultati soddisfacenti. Qui riportiamo condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e la diminuzione colorazione di fondo, entrambi i quali erano i problemi quando l'applicazione di approcci consolidati. Ottimizzazioni includono: (1) incubazione di proteasi K (1 mg / ml, 10 min), che è stato trovato f essenzialeo la penetrazione degli anticorpi negli embrioni metà e in fase avanzata di afidi; (2) la sostituzione di siero normale di capra / albumina sierica bovina con un reagente bloccante fornito da un digossigenina (DIG) a base di tamponamento impostato e (3) l'applicazione di metanolo piuttosto perossido di idrogeno (H _{2 O 2)} per candeggio perossidasi endogena; che ha ridotto in modo significativo la colorazione di fondo nei tessuti afidi. Queste condizioni critiche ottimizzate per immunostaining permetteranno efficace rilevazione dei prodotti genici negli embrioni di A. Pisum e altri afidi.

Introduction

Gli afidi sono insetti hemipteran con piccoli (1-10 mm) corpi morbidi. Si nutrono di piante succhiando linfa floema con apparato boccale di piercing. Inoltre, si basano su un batterio endosimbiontica obbligato, Buchnera aphidicola, per sintetizzare aminoacidi essenziali che sono carenti nella dieta linfa floematica. Afidi hanno una storia di vita complesso che comprende partenogenetica riproduzione vivipara durante la primavera e l'estate fotoperiodo lungo il giorno e sessuale riproduzione ovipara innescato dal fotoperiodo breve-day, durante il quale essi definite un numero limitato di uova svernanti ^1,2. In primavera queste uova si schiudono per produrre la prima generazione di tutto al femminile afidi (fundatrices), dopo molti cicli di riproduzione partenogenesi fino all'autunno. La partenogenesi congiunturale afidi, dove le fasi asessuata e sessuale si alternano nel ciclo di vita annuale, è stato considerato come un ^1,2 novità evolutiva. Nei afidi vivipari partenogenetiche, Embriogenesi avviene entro le camere di uova dei tubuli ovariche (ovarioli). Al contrario, gli embrioni sessuali ovipare sviluppano nelle uova fecondate. A parte la plasticità riproduttiva, gli afidi possono visualizzare transgenerazionale ala polyphenism: in risposta a segnali di sovraffollamento e minacce predatori, le femmine asessuate unwinged possono vivipare produrre prole alato per la migrazione a lunga distanza. Pubblicazione della sequenza del genoma del afide del pisello Acyrthosiphon pisum -la prima sequenza del genoma di un basale insetti permette emimetaboli un'ulteriore esplorazione della plasticità riproduttiva, ala polyphenism, e altre funzioni, tra cui le interazioni insetto-pianta, vectoring virale e simbiosi di afidi su un molecolare base ^3.

Oltre al genoma sequenziato, strumenti per la caratterizzazione espressione e funzione del gene sono necessari per la promozione del pisello come modello maturo organismo ^4. Abbiamo descritto robusti protocolli di tutto-mount <em> in ibridazione in situ per rilevare l'espressione di mRNA in embrioni di afidi ^5-7. RNA interference (RNAi) via a doppio filamento iniezione di RNA e l'alimentazione è stato utilizzato per il silenziamento genico in ninfe afidi e negli adulti, ma condizioni stabili per gene atterramento negli embrioni non sono ancora stati segnalati ^8-10. Immunocolorazione, un approccio a base di anticorpi in grado di rilevare l'espressione della proteina in campioni prima e dopo RNAi smontabile, è stata eseguita su embrioni pisello afide ^11-13. Tuttavia, l'aumento di permeabilità dei tessuti e l'eliminazione di colorazione di fondo sono ancora insoddisfacenti utilizzando protocolli standard per immunocolorazione negli embrioni vivipare asessuate del pisello. Per esempio, abbiamo scoperto che la penetrazione di anticorpi ai tessuti diminuita negli embrioni gastrulating (stadi 8-10) e che gli embrioni con germogli arti morfologicamente identificabili (fasi 13-14) erano appena permeabile all'anticorpo. Inoltre, la colorazione di fondo è stato visualizzato nel viviparo asessuatanoi pisello embrioni afidi colorate usando anticorpi contro il marcatore linea germinale Vasa così come quella contro la proteina engrailed / Invected espressa nei segmenti embrionali ^12,13. In realtà la colorazione di fondo era ancora chiaramente visibile in embrioni colorati con il solo anticorpo secondario.

Al fine di aumentare la permeabilità senza danneggiare l'integrità dei tessuti afidi, abbiamo titolato accuratamente la concentrazione di proteinasi K e determinati condizioni ottimali per la digestione tessuto su embrioni afidi. Per evitare marcatura non specifica del pisello, abbiamo cercato composti che potrebbero bloccare efficacemente embrioni e sopprimere l'attività di perossidasi endogena (POD), un enzima impiegato per amplificare segnali durante la immunocolorazione. Un reagente di blocco fornita da un digossigenina (DIG) gruppo di tamponi based, piuttosto il siero di capra normale usato tradizionalmente (NGS) / albumina di siero bovino (BSA), ha ridotto significativamente la colorazione di fondo. Inoltre, il metanolo è stato trovato per INHIbit dell'attività POD endogena più efficacemente di perossido di idrogeno (H _{2 O 2).} I dettagli riguardanti queste condizioni specifiche di afidi per immunocolorazione sugli embrioni verranno descritti nelle sezioni seguenti.

Protocol

1. Cultura di Afidi NOTA:. Il ceppo di laboratorio del partenogenetica vivipara pisello afide Un pisum sono stati originariamente raccolti nel centro di Taiwan ed è stato allevato su piante ospiti (sativum giardino di piselli Pisum o fava favino) sotto-giorno lungo fotoperiodo per più di 300 generazioni (una generazione: ~ 10 giorni). Germinazione dei semi Mettere a bagno i semi di piante ospiti in acqua di rubinetto per 3-5 giorni a temperatura …

Representative Results

In questo studio, abbiamo eseguito tutto il monte-immunocolorazione sugli embrioni di afidi pisello asessuati (Figura 1A). Queste femmine producono prole per partenogenesi e vivipare. Questi embrioni di sesso femminile si sviluppano all'interno di camere d'uovo dei tubuli ovariche (ovarioli) (Figura 1B e Figura 2A). Prima di microscopia, i ovarioli sezionato sono gli obiettivi di colorazione; tuttavia, è necessa…

Discussion

Abbiamo identificato condizioni ottimali critiche dell'immunocolorazione successo nel pisello afide A. Pisum, un organismo modello emergente per studi di genomica e di sviluppo ^3,15. Condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e ridurre la colorazione di fondo migliorato l'intensità e la specificità dei segnali. Si differenziano dai protocolli standard per immunocolorazione in altri modelli animali nei passaggi per la creazione di pori nella membrana cellulare…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.