التفريق بين الرجفان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام BMP خصم Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
وقد وضعت بروتوكولات لتوليد سكان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة، ولكن هذه تسفر عادة خلايا الظواهر مختلطة. تتطلب الباحثين الراغبين في متابعة الدراسات التي شملت فرعية العضلية محددة نهج التمايز أكثر توجيهات. عن طريق التعامل مع الماوس الجذعية الجنينية (ES) الخلايا مع Grem2، وهو خصم BMP يفرز ما هو ضروري لتشكيل غرفة الأذيني في الجسم الحي، ويمكن إنشاء عدد كبير من خلايا القلب مع النمط الظاهري الأذيني. استخدام المحفزة خط الخلايا الجذعية Myh6-عن dsRed-مجلس التوحيد الوطنى هندسيا يسمح لتحديد واختيار، وتنقية الخلايا العضلية. في هذا البروتوكول يتم إنشاؤها الهيئات مضغي من خلايا Myh6-عن dsRed-مجلس التوحيد الوطنى باستخدام طريقة قطرة شنقا وأبقى في تعليق حتى يوم التمايز 4 (D4). في الخلايا D4 تعامل مع Grem2 ومطلية على لوحات الجيلاتين المغلفة. بين لوحظ D8-D10 المناطق المقاولات الكبيرة في الثقافات والاستمرار في توسيع ومature من خلال D14. الجزيئية، والتحليلات النسيجية وelectrophysiogical تشير الخلايا في الخلايا المعالجة Grem2-يكتسب خصائص تشبه الأذيني تقديم نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا العضلية الأذينية واستجابتها لمختلف وكلاء الدوائية.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة هي أداة قوية لتوليد ودراسة الخلايا من مجموعة من الصعب الأنسجة الوصول للبحوث والدراسات ما قبل السريرية الأساسية، لا سيما في البشر 1-5. تعديل السليم لمسارات الإشارات التنموية يمكن توجيه تمايز الخلايا الجذعية المحفزة لمصير المظهرية المطلوب. وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتوليد العضلية (CMS) من الخلايا الجذعية المحفزة 6-14. تتضمن هذه البروتوكولات عموما تعديل من TFGβ الفصيلة (Activin، BMP، وTGFβ) والممرات من خلال إضافة موقوتة من عوامل النمو الخارجية و / أو جزيئات صغيرة 10،12-15 WNT. هذه البروتوكولات غالبا ما تكون فعالة في زيادة نسبة الخلايا التي تصبح مضادة، ولكن تفتقر إلى التحديد، وتوليد يقطنها خليط سكاني من الخلايا التي تمثل الأنساب الأذيني، البطين، والنظام العقدي / التوصيل. من أجل دراسة القلب محدد فرعية لAPPRO التمايز أكثر موجهةمطلوب منظمة العمل ضد الجوع.
Gremlin2 (Grem2، وتسمى أيضا البروتين المتصلة دان وسيربيروس أو PRDC قصيرة) هو خصم BMP يفرز ما هو ضروري للتمايز القلب السليم وتشكيل غرفة الأذيني خلال تطوير القلب في الزرد 16. علاج تمييز الخلايا الجذعية الجنينية مع Grem2 في التمايز يوم 4، بعد ذروة التعبير عن علامات أرومية متوسطة T-براتشيوري وسيربيروس مثل 1، ويزيد من غلة مضادة ويولد مجموعة من الخلايا في الغالب من سلالة الأذيني 14.
يستخدم المؤتلف Grem2 لعلاج الخلايا التفريق ويمكن أن يتم باستخدام تقنيات إنتاج البروتين القياسي 17 أو يمكن شراؤها تجاريا. وهو قابل للذوبان عالية في المحاليل المائية ويمكن أن يضاف خارجيا على الثقافات في نقطة الوقت المطلوب.
يمكن تتبع التمايز باستخدام RT-QPCR لقياس التعبير عن ممثل علاماتمن الأسلاف القلب والأوعية الدموية، الأسلاف القلب، وملتزمة مضادة. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعي لتحديد وتصور التوزيع المكاني لأنواع الخلايا في القلب.
يتم تنفيذ التطبيقات التي تتطلب مجموعات نقية بسهولة أكبر من عند استخدام نظام مراسل لتحديد وعزل مضادة. لهذا الغرض، أدخلنا αMHC-DsRedNuc بناء في خط خلية الماوس CGR8 ES 14. خلايا CGR8 تنمو وتبقى المحفزة دون الخلايا المغذية، وتسهيل التوسع والتمايز فحوصات 18. يحتوي على خط خلية ES لعن dsRed البروتين الفلوري تسلسل الترميز مع إشارة توطين النووية تحت القلب محددة ألفا سلسلة الميوسين الثقيلة (ألفا MHC أو Myh6) مروج الجين. باستخدام هذه الخلايا، مضادة يمكن التعرف عليها بسهولة ومعزولة لتقدير، فرز الخلايا، الكهربية، شاشات المخدرات، ودراسة آليات التمايز الأذيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول تنتج بشكل روتيني الثقافات التي تحتوي على نسبة عالية من مضادة التي هي سمة من سلالة الأذيني. كما هو الحال مع أي بروتوكول التمايز، ينبغي إيلاء جودة mESCs قبل التمايز اهتماما خاصا. mESCs ينبغي رصد روتيني لالتشكل الصحيح (الشكل 1A). فإن أي التمايز عفوية أن …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL083958 وHL100398 (AKH) و2T32HL007411-33 "برنامج في القلب والأوعية الدموية الآليات: التدريب في التحقيق" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
