Murine Hind Limb Long Bone Dissection og benmarg Isolation

Summary

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Abstract

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Introduction

The study of long bones and the cells of the bone marrow is central to a myriad of research disciplines, including, but not limited to, bone biology, cancer biology, immunology, hematology, and biomechanics. The bone is a highly dynamic organ that together with the cartilage forms the skeleton to provide mechanical support against loading and protection of the internal organs. In addition, the mineral components of bone are a storage sink for the critical signaling molecules calcium and phosphorus, as well as other factors¹. Finally, bones house the bone marrow and, together with metabolically active bone forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts, provide the stem cell niche necessary for the maintenance of hematopoietic and lymphoid cell populations.

Bone and bone marrow are affected in many disorders, often leading to bone marrow dysfunction, severe bone pain, and pathologic fracture. Bone is a common site of metastasis in many solid tumors, most notably breast cancer and prostate cancer, where tumor cells directly engage the bone marrow niche to initiate the vicious cycle of bone metastasis and displace hematopoietic stem cells^2,3. Hematopoietic malignancies including myeloma and leukemia are characterized by bone marrow dysfunction as well as deregulation of healthy bone remodeling¹. Other non-malignant skeletal disorders are also active areas of research, such as osteoarthritis, osteoporosis, scoliosis, and rickets. Even in an otherwise healthy individual, biomechanical failure in a bone leads to a painful fracture. All of these disorders represent active areas of research with the goal of identifying new preventative measures and treatment regimens to reduce morbidity and mortality.

To research the plethora of roles of the bone and the bone marrow, both under physiologic and pathologic conditions, it is critical for researchers to have a simple and efficient standardized method for dissection of the mouse long bones for rapid processing of large in vivo experiments. The dissection protocol outlined here is suitable for all long bone analyses including ex vivo imaging, histology, histomorphometry, and strength testing, among others. Similarly, a standardized bone marrow isolation method with high bone marrow cell recovery and low inter-user variability is important for experimental analysis such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or quantitative PCR (qPCR) as well as downstream applications such as primary cell culture of bone marrow cells.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i samsvar med anbefalingene som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. 1. Hind Limb Long Bone Dissection Avlive mus i overensstemmelse med institusjonens retningslinjer. Plasser musen i liggende stilling og fest ved å feste alle fire ben gjennom musetredeputer nedenfor ankelleddet. Spray mus med 70% etanol, grundig gjengen bena. Lag et lite snitt til høyre for midtlinjen i nedre del av magen, like over hoften. Utvid snittet nedover beinet og forbi ankelleddet. Trekk tilbake huden og skjær quadriceps muskel forankret til nærmeste enden av femur å avsløre fremre side av femur og pin ut fra beinet, plassere pinnen i en 45 graders vinkel fra brettet. Med blade av saksen mot den bakre side av lårbenet, skjæres hamstrings bort fra kneleddet. Trekk tilbake huden og hasesenemusklene forankret til nærmeste enden av femur å avsløre den bakre side av femur og pin ut fra benet, plassere pinnen i en 45-graders vinkel fra brettet. Med pinsett, holder den distale ende av lårbenet, like over kneleddet. Guide bladene på saksen på hver side av femoral akselen mot hofteleddet, være forsiktig med å skjære i femur selv. Etter å ha nådd lårbenshodet, angitt med saksen åpningen litt, vri saksen med toppen blad av saksen bevegelige direkte over lårbenshodet å forrykke femur, være forsiktig med å knipse beinet under lårbenshodet. Ta tak i toppen av femoral akselen med pinsett, kutte bløtvev unna lårbenshodet for å løsne den fra acetabulum. Trekk hele benet bein, inkludertfemur, kne, og tibia, opp og bort fra kroppen, forsiktig bortskjæring av bindevev og muskel som forbinder benet til huden. Overutstrekke ankelleddet og igjen bruke saksen i en vridende bevegelse for å forrykke tibia. Gripe den distale enden av tibia, tar seg ikke å kutte sener, trekke tibia opp og bort fra kroppen og pin bord. Skjær eventuelle gjenværende bindevev feste lange ben til musen ved kneet. Fjern alle ekstra muskel- eller bindevev festet til femur og tibia. For noen applikasjoner som krever bein å være intakt (histologi, histomorfometri, biomekanisk testing, osv.), Fortsetter med standard in-house-protokoller (som i 4-7). For å isolere benmargen, fortsett til punkt 2. 2. Langt Bone Forberedelse til Bone Marrow Isolation Ved hjelp av pinsett, ta tak i femur med patella vender bort ennd proksimale ende (lårbenshodet) ned. Overutstrekke kneleddet og bruke saks i en vridende bevegelse for å forrykke tibia og femur. Skjær noen bindevev som holder femur og tibia sammen. Ved hjelp av pinsett, ta tak i femur med fremre side vender bort og den proksimale enden (lårbenshodet slutten) ned. Guide saksen opp femoral akselen til kondylene. Forsiktig rotere saksen frem og tilbake for å fjerne kondylene, patella, og den epiphysis å eksponere metafyse. Fjern alle ekstra muskler eller bindevev festet til femur ved hjelp av tang, saks, og Kimwipes. Ved hjelp av pinsett, ta tak i tibia ved fremre side vender bort og den distale enden (ankel ende) ned. Hvis tibial epifysen er intakt, veilede saksen opp tibia akselen til kondylene. Forsiktig rotere saksen frem og tilbake for å fjerne kondylene og epifysen å eksponere metaphysis. Fjern alle ekstra muskler eller bindevev knyttet til tibia ved hjelp av tang, saks, og Kimwipes. 3. Bone Marrow Isolation Presse en 18 G nål gjennom bunnen av et 0,5 ml mikrosentrifugerør. Plasser de lange knokler (maksimalt 2 lårben og to skinneben) inn i røret, kne-end ned ende ned og lukk lokket. Nest 0,5 ml mikrosentrifugerør i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger opplagrede rør på ≥10,000 xg i en mikro for 15 sek. Kontroller at benmargen er skilt ut av knoklene ved visuell inspeksjon. Benene skal vises hvitt og det bør være en stor visuell pellet i det større rør. Kast 0,5 ml mikrosentrifugerør med bein. Heng benmargen i passende løsning (for eksempel PBS, dyrkingsmedier, FACS buffer) og fortsette med forsøksprotokoll (DNA, RNA, eller protein isolasjon,FACS-analyse, eller primær cellekultur).

Representative Results

Protokollen er beskrevet her er optimalisert for hurtig disseksjon av musen femur og tibia med et minimum av skade på benvev. Denne teknikk er egnet for en rekke nedstrøms analyser, inkludert Biomekanikk studier, histomorfometri (figur 1 A – B), og histologi (figur 1C) 4,7. Den representative histomophometric micoCT 3D rekonstruksjon (figur 1 A – B) demonstrerer at både porøst ben og kortikale skall opprettholdes som gir mulighet for nøyaktig kvantifisering av de standardiserte konstruksjonsparametre for benhistomorfometri, inkludert trabekulært antall, tykkelse og avstanden; bein volum; og kortikal tykkelse, blant annet ved 8. Representanten histologisk snitt viser en H & E beiset formalinfiksert og decalcified tibia (figur 1C). Bildet viser integriteten både forkalket ben og mobilnettet benmarg for histologisk analyse. Benmargen isoleringsprosedyren bevarer sterilitet i beinmargen plass, har lav håndtering for å redusere forurensning, og krever ikke kutting av lange bein, og dermed redusere tap av beinmargen yield. Dette benmargen er egnet til mange nedstrøms applikasjoner, inkludert flowcytometri 5 og PCR-analyser. Dessuten kan denne fremgangsmåten brukes til å isolere benmarg for primær cellekultur av benmargceller, inkludert osteoklaster og osteoblaster (Figur 2A – B) 4,6. Figur 1. Histomorphological og Histologiske Analyser av Mouse Long Bone. Tredimensjonal microCT rekonstruksjon av en mus tibia viser (A) den ytre kortikale shell og (B </s trong>) trabekulært ben (skala bar = 0.5 mm). (C) Histologisk H & E flekken av en decalcified og seksjonert tibia (4x). Bilder gjengitt med tillatelse av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2 Primær Bone Marrow Cell Kultur for Differensiering av osteoklaster og Osteoblaster. (A) TRAP farging for multinucleated osteoklaster etter 7 dager i osteoclastogenic media (4x). (B) alkalisk fosfatase (lilla farge) for osteoblaster og Alizarin rød (rød farge) flekken for mineralisering etter 21 dager i osteogene media. Bilder gjengitt med tillatelse av Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg «target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

We present a simple and efficient method for removal of mouse hind long bones and subsequent bone marrow isolation. This method maintains the high structural and cellular integrity of the bones and bone marrow and has low handling time, minimizing the likelihood of user-induced fracture or bone scoring that may influence downstream analyses. In addition, the centrifugation method for isolating bone marrow does not require cutting the bone to expose the bone marrow space or fluid to flush the bone marrow, reducing potential points of contamination. Moreover, the centrifuge technique is relatively high-throughput with lower hands-on time than other methods, thus reducing processing time.

High variation is inherent to in vivo mouse studies due to high mouse-to-mouse phenotypic variation. In order to maximize the research impact of expensive and labor-intensive mouse studies, it is critical to minimize technical experimental error^9,10. Time from animal sacrifice to downstream analysis or tissue fixation introduces experimental variation that may overcome subtle changes and reduce large differences between groups. Therefore, rapid processing of samples is essential for accurate data analysis. The long bone dissection and bone marrow isolation techniques described here are optimized for rapid processing of animals and samples to reduce technical variation.

This protocol can be widely applied to many research fields, including investigation of the bone tissue itself or interrogation of the cells of the bone marrow. In addition, this straightforward approach to long bone dissection will enable researchers in related fields to directly interrogate bone contributions in order to expand our knowledge of bone marrow dysfunction in otherwise understudied pathologies.

Materials

pinboard
pins
70% ethanol
dissection sissors
dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 guage needle
1.5 ml microcentrifuge tube
0.5 ml microcentrifuge tube
microcentrifuge