Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Summary

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Abstract

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Introduction

The study of long bones and the cells of the bone marrow is central to a myriad of research disciplines, including, but not limited to, bone biology, cancer biology, immunology, hematology, and biomechanics. The bone is a highly dynamic organ that together with the cartilage forms the skeleton to provide mechanical support against loading and protection of the internal organs. In addition, the mineral components of bone are a storage sink for the critical signaling molecules calcium and phosphorus, as well as other factors¹. Finally, bones house the bone marrow and, together with metabolically active bone forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts, provide the stem cell niche necessary for the maintenance of hematopoietic and lymphoid cell populations.

Bone and bone marrow are affected in many disorders, often leading to bone marrow dysfunction, severe bone pain, and pathologic fracture. Bone is a common site of metastasis in many solid tumors, most notably breast cancer and prostate cancer, where tumor cells directly engage the bone marrow niche to initiate the vicious cycle of bone metastasis and displace hematopoietic stem cells^2,3. Hematopoietic malignancies including myeloma and leukemia are characterized by bone marrow dysfunction as well as deregulation of healthy bone remodeling¹. Other non-malignant skeletal disorders are also active areas of research, such as osteoarthritis, osteoporosis, scoliosis, and rickets. Even in an otherwise healthy individual, biomechanical failure in a bone leads to a painful fracture. All of these disorders represent active areas of research with the goal of identifying new preventative measures and treatment regimens to reduce morbidity and mortality.

To research the plethora of roles of the bone and the bone marrow, both under physiologic and pathologic conditions, it is critical for researchers to have a simple and efficient standardized method for dissection of the mouse long bones for rapid processing of large in vivo experiments. The dissection protocol outlined here is suitable for all long bone analyses including ex vivo imaging, histology, histomorphometry, and strength testing, among others. Similarly, a standardized bone marrow isolation method with high bone marrow cell recovery and low inter-user variability is important for experimental analysis such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or quantitative PCR (qPCR) as well as downstream applications such as primary cell culture of bone marrow cells.

Protocol

Все для животных работа была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. 1. Hind Лимб длинных трубчатых костей Рассечение Эвтаназии мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Поместите мышь в положении лежа на спине и наклейте закрепив все четыре ноги через мышь подушечки лап ниже голеностопного сустава. Спрей мышь с 70% этанола, тщательно обливание ног. Сделайте небольшой надрез справа от средней линии в нижней части живота, чуть выше бедра. Расширьте надрез вниз по ноге и мимо голеностопного сустава. Оттяните кожу и разрезать четырехглавой мышцы, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить переднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта. С Bladе ножниц против задней стороны бедра, отрежьте бицепсы от коленного сустава. Оттяните кожу и мышцы подколенного сухожилия, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить заднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта. С помощью щипцов, удерживая дистальный конец бедренной кости, чуть выше коленного сустава. Руководство лезвия ножниц по обе стороны от бедренной кости к тазобедренного сустава, стараясь не врезаться в самой бедренной кости. После достижения головки бедренной кости, с указанием ножниц открытия слегка скрутите ножницы с верхним лезвием ножниц, движущихся непосредственно над головки бедренной кости вывихнуть бедренной кости, стараясь не замкнуть кости ниже головки бедренной кости. Возьмитесь за верхнюю часть бедренной кости с пинцетом, разрезал мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить его от вертлужной. Вытащите всю кость ноги, в том числебедренной кости, колена и голени, вверх и в сторону от тела, тщательно срезая соединительной ткани и мышц, соединяющий ногу к коже. Перенапрягать голеностопный сустав и снова использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой кости. Схватив дистального конца большеберцовой кости, следя за тем, чтобы не перерезать сухожилия, потяните голень вверх и в сторону от тела и пин-плате. Вырезать все оставшиеся соединительной ткани имеется длинный кость мыши в колене. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной и большеберцовой кости. Для любых приложений, требующих кости , чтобы оставаться неповрежденными (гистология, Гистоморфометрия, биомеханические тестирование и т.д.) . , Действуйте со стандартными протоколами в доме (как в 4-7). Чтобы изолировать костный мозг, переходите к разделу 2. 2. Длинные косточки Подготовка к изоляции костного мозга Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с надколенника лицом прочьй проксимальный конец (головка бедренной кости) вниз. Перенапрягать коленного сустава и использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой и бедренной костями. Вырезать любой соединительной ткани, проведение бедренной и большеберцовой костей вместе. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с передней стороны, обращенной в сторону и проксимального конца бедренной кости (конец головки) вниз. Руководство ножницы вверх бедренной кости к мыщелков. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков, коленной чашечки, и эпифиз выставить метафиза. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes. Используя пинцет, возьмитесь за голень с передней стороны, обращенной в сторону и дальний конец (конец голеностопа) вниз. Если большеберцовой эпифиза цела, руководство ножницами вверх большой берцовой кости вала до мыщелков. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков и эпифиз, чтобы выставить metaphлиз. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к большеберцовой кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes. 3. Выделение костного мозга Принудительную 18 G иглу через нижнюю часть 0,5 мл трубки микроцентрифужных. Поместите длинные кости (максимум 2 бедрами и голенями 2) в трубку, по колено конец вниз концом вниз и закройте крышку. Гнездо 0,5 трубки микроцентрифужных мл в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Центрифуга вложенными пробирки при ≥10,000 XG в микроцентрифуге в течение 15 сек. Убедитесь в том, что костный мозг был растягивал из костей с помощью визуального осмотра. Кости должны выглядеть белым и не должно быть большой визуальный осадок в большую трубу. Откажитесь от 0,5 мл микроцентрифужных трубку с костями. Приостановка костный мозг в соответствующем растворе (например, PBS, культуральные среды, FACS буфер) и продолжить экспериментальный протокол (ДНК, РНК или выделения белка,Анализ FACS, или первичной культуры клеток).

Representative Results

Протокол, описанный здесь, оптимизирован для быстрой рассечения бедренной кости мыши и большеберцовой кости с минимальным повреждением костной ткани. Этот метод подходит для целого ряда последующих анализов, включая исследования биомеханики, гистоморфометрии (рис 1А – В) и гистологии (рис 1C) 4,7. Представитель histomophometric micoCT 3D реконструкция (Рисунок 1А – B) показывает , что как губчатой ​​кости и кортикального оболочки сохраняются , что позволяет точно оценить стандартизированных структурных параметров для гистоморфометрии кости, в том числе губчатой ​​количества, толщины и расстояния; объем костной ткани; и кортикальную толщину, среди прочих мер 8. Представитель гистологические секции показывает H & E окрашивали фиксированные формалином и декальцинированной берцовой (рис 1C). Изображение демонстрирует целостность обоих кальцифицированного Ьодин и клеточный костный мозг для гистологического анализа. Процедура костного мозга изоляция сохраняет стерильность пространства костного мозга, имеет низкую обработку для снижения загрязнения, и не требует нарезку длинной кости, тем самым уменьшая потери урожая костного мозга. Этот костный мозг подходит для многих последующих применений, в том числе проточной цитометрии 5 и ПЦР – анализ. Кроме того, эта процедура может быть использована для выделения костного мозга для первичной культуры клеток клеток костного мозга, в том числе остеокластов и остеобластов (фиг.2А – B) -4,6. Рисунок 1. Гистоморфологические и гистологические анализы мышей длинных трубчатых костей. Трехмерная microCT реконструкция большеберцовой кости мыши , показывая (A) наружный кортикальный оболочку и (B </s Чонг>) губчатая кость (масштаб бар = 0,5 мм). (C) Гистологическое H & E пятно в декальцинированной и секционного большеберцовой кости (4x). Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Первичная костного мозга Культура клеток для дифференциации остеокластов и остеобластов. (A) TRAP окрашивание на многоядерные остеокластов через 7 дней в osteoclastogenic средах (4x). (В) щелочной фосфатазы (фиолетовый цвет) для остеобластов и ализарин красный (красный цвет) пятно для минерализации после 21 дней в остеогенной СМИ. Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США.Iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

We present a simple and efficient method for removal of mouse hind long bones and subsequent bone marrow isolation. This method maintains the high structural and cellular integrity of the bones and bone marrow and has low handling time, minimizing the likelihood of user-induced fracture or bone scoring that may influence downstream analyses. In addition, the centrifugation method for isolating bone marrow does not require cutting the bone to expose the bone marrow space or fluid to flush the bone marrow, reducing potential points of contamination. Moreover, the centrifuge technique is relatively high-throughput with lower hands-on time than other methods, thus reducing processing time.

High variation is inherent to in vivo mouse studies due to high mouse-to-mouse phenotypic variation. In order to maximize the research impact of expensive and labor-intensive mouse studies, it is critical to minimize technical experimental error^9,10. Time from animal sacrifice to downstream analysis or tissue fixation introduces experimental variation that may overcome subtle changes and reduce large differences between groups. Therefore, rapid processing of samples is essential for accurate data analysis. The long bone dissection and bone marrow isolation techniques described here are optimized for rapid processing of animals and samples to reduce technical variation.

This protocol can be widely applied to many research fields, including investigation of the bone tissue itself or interrogation of the cells of the bone marrow. In addition, this straightforward approach to long bone dissection will enable researchers in related fields to directly interrogate bone contributions in order to expand our knowledge of bone marrow dysfunction in otherwise understudied pathologies.

Materials

pinboard
pins
70% ethanol
dissection sissors
dissection forceps
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 guage needle
1.5 ml microcentrifuge tube
0.5 ml microcentrifuge tube
microcentrifuge