LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial
Summary
Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
Metabolismo mitocondrial disfuncional se ha implicado en una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración, el cáncer y la enfermedad cardiovascular 30. Como tal, un gran esfuerzo se ha colocado en la caracterización de defectos metabólicos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS / MS) se considera el estándar de oro para la cuantificación de analitos de matrices biológicas complejas y con frecuencia se emplea para estudios metabólicos 8. Sin embargo, como es a menudo el caso con los estudios biomédicos, la consecución de un modelo accesible y bien definida correspondiente a la enfermedad humana es un desafío.
Muchos estudios emplean modelos celulares transformadas para sondear el impacto de xenobióticos o anomalías genéticas en el metabolismo celular 7,9. La reprogramación metabólica que se produce en las células cancerosas pueden introducir factores de confusión 21 y por lo tanto no son ideales. Estos problemas pueden ser circumvented con modelos celulares primarios, aunque la obtención de biomasa suficiente para los análisis metabólicos puede ser un reto. Por otra parte, el impacto de altas cantidades de antibióticos que se utilizan en la cultura se ha destacado como estudios mitocondriales 16 de confusión potenciales.
Las plaquetas humanas ofrecen la oportunidad de utilizar un modelo celular primario con suficiente contenido mitocondrial para estudios metabólicos 5,22,27,32. En primer lugar, las plaquetas se pueden adquirir fácilmente, a través de la extracción de sangre de donantes individuales, o en grandes volúmenes de bancos de sangre, y por lo tanto proporcionar un modelo en el que factores externos pueden ser controlados fácilmente. En segundo lugar, debido a su pequeño tamaño, las plaquetas pueden ser fácilmente aislados de otros componentes de la sangre con un mínimo de trabajos de preparación en laboratorios incluso mínimamente equipados 5. Es de destacar que las plaquetas no contienen núcleos y por lo tanto se pueden utilizar para estudiar alteraciones en el metabolismo de manera independiente de la regulación transcripcional. Aquí nos muestran queAdemás de la cuantificación relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), el sistema de plaquetas aislado se puede utilizar para examinar el metabolismo del carbono. En concreto, el informe de uso de marcaje metabólico con isótopo estable (no radiactivo) marcado con [13 C 6] -glucosa y [13 C 16] palmitato para sondear la incorporación de [13C] -label en el metabolito importante acetil- CoA a través de la glicólisis o de la oxidación de ácidos grasos. Esto proporciona una plataforma de gran alcance, generalizable, y versátil debido a la amplia participación de especies acil-CoA reductasa en las vías bioquímicas 13,24 y la tratabilidad de este sistema para probar otras variables, tales como la inhibición del complejo I con rotenona 3,33. Además de la información proporcionada en el Protocolo a continuación, una descripción detallada de los métodos utilizados para el etiquetado de isótopos y para los análisis basados en CL-EM se puede encontrar en Basu y Blair 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos demostrado la utilidad de plaquetas aisladas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial perturbado. En concreto, hemos caracterizado adaptación metabólica en respuesta a la inhibición del complejo I de la rotenona.
El presente estudio se ha extendido hallazgos presentados con anterioridad sobre el papel de la inhibición del complejo I de la rotenona en líneas celulares a las plaquetas humanas. Es importante destacar que esto se ha puesto de manifiesto q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo de NIH subvenciones P30ES013508 y T32ES019851.
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
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