Mesures autoradiographiques de [¹⁴ C] -Iodoantipyrine dans le cerveau de rat Après post-AVC Central Douleur

Summary

We present a protocol to measure [¹⁴C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Abstract

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [¹⁴C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [¹⁴C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [¹⁴C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

Introduction

L' hémorragie de l' AVC a été observé chez plus de 8% des patients qui souffrent de douleurs neuropathiques, appelé à la douleur post-accident vasculaire cérébral central (CPSP). ^1-3 PCSP peut résulter d' un dysfonctionnement somatosensoriel, induisant ainsi l' hypersensibilité et l' allodynie. ⁴ Cependant , les mécanismes physiopathologiques de dysfonctionnement somatosensoriel dans PCSP demeurent incertaines. Par exemple, la perte de sensations somatiques résultant de désafférentation neuronale dans la région hémorragique cérébral. Hyperalgésie peut être provoquée par l'hyperexcitabilité des neurones nociceptifs centraux ou désinhibition central, ^{5, 6} , mais les substrats neuronaux qui sont impliqués dans les symptômes PCSP restent inconnus. Certaines études ont suggéré que le préfrontal dorsolatéral cortex (DPFC), rostrale cortex cingulaire antérieur (ACC), amygdale, hippocampe, grise périaqueducale (PAG), medulla ventromédian rostrale, et leurs liens avec l'autre médiation traitement nociceptive. ⁷ supplémentairesly, cortex préfrontal médian (CPFm) circuits -amygdala se sont révélés être impliqués dans la perception liée à la douleur. ⁸ Les données sur les mécanismes physiopathologiques de PCSP sont diverses, et l'activation de substrats neuronaux dans PCSP a besoin un examen plus approfondi.

^[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) absorption est utilisé pour observer indirectement le débit sanguin cérébral régional (DSCr), en supposant une relation entre l' activité cérébrale et CBF. Bien que ^[14 C] -IAP ne peut évaluer l' activité du cerveau en temps réel, telles que l' imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), il présente plusieurs avantages. Par exemple, ^[14 C] -IAP est adapté pour mesurer spontanément se produire des événements du cerveau au cours d' états pathologiques. ⁹ En outre, ^[14 C] -IAP absorption est mesurée sans anesthésie. Il en coûte également moins que d'autres méthodes d'imagerie, y compris l'IRMf et la tomographie par émission de positons (TEP). La ^[14 C] -IAP méthode a été proposée pour être approprié pour measuring douleur spontanée (par exemple PCSP) qui est induite par des lésions du noyau de base ventrale (VB) du thalamus. ⁹

Le présent protocole décrit comment effectuer la ^[14 C] -IAP méthode pour évaluer l'implication des substrats neuronaux de PCSP qui est induite par des lésions de la VB du thalamus dans un modèle animal. La technique offre un moyen de déterminer les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent les symptômes PCSP aux niveaux comportementaux et neuronaux.

Protocol

Le protocole de la présente étude a reçu l'approbation de l'Academia Sinica Institutional Animal Care et Comité d'utilisation à Taiwan. 1. Préparations des animaux Obtenir des rats mâles Sprague-Dawley (environ 3-400 g). Maintenir les rats dans une salle climatisée (21 – 22 ° C, 50% d'humidité) sous 12 h 12 h cycle lumière / / obscurité (lumières allumées à 08h00) avec un accès libre à la nourriture et de l'eau. …

Representative Results

La figure 1A représente la chronologie expérimentale. Les rats ont été assignés à l'imposture et les groupes PCSP pour les tests de comportement (c. -à- von Frey essai et plantaire test). Le premier jour de l'expérience a servi de base, et des tests ont été répétés aux semaines 1 – 5. PE-50 cathétérisme a été réalisée dans la veine jugulaire externe à la semaine 4. Héparine (20 U / ml, 0,1 ml / jour) a été injecté au cours semaine…

Discussion

Dans les tests de comportement, le groupe PCSP présentait des réductions du seuil de retrait de la patte dans le test de la douleur thermique et force mécanique dans le test von Frey à l' inclusion et les semaines 1 -. 5. Les résultats étaient compatibles avec une étude précédente ¹⁴

La ^[14 C] -IAP méthode repose sur l'intensité de pixel des images du cerveau pour l'analyse quantitative des différentes tranches de cerveau. Pour évaluer les donn?…

Materials

Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5-37.5°C.
10µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs:
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55°C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55°C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20°C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.