Autoradiografe Målinger av [¹⁴ C] -Iodoantipyrine i Rat Brain Etter Central Post-Stroke Pain

Summary

We present a protocol to measure [¹⁴C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Abstract

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [¹⁴C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [¹⁴C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [¹⁴C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

Introduction

Slag blødning har vist seg å forekomme i mer enn 8% av pasientene som lider av nevropatisk smerte, referert til som sentral etter-slag smerte (CPSP). ^1-3 CPSP kan resultere fra somatosensory dysfunksjon, for derved å indusere overfølsomhet og allodyni. ⁴ men de patofysiologiske mekanismer for somatosensoriske dysfunksjon i CPSP fortsatt usikre. For eksempel tap av somatiske fornemmelser resulterer fra neuronal deafferentation i hemoragisk hjerneområde. Hyperalgesi kan være forårsaket av hyperexcitability av sentrale nociceptive neuroner eller sentral disinhibition, ^{5, 6,} men de nevrale underlag som er involvert i CPSP symptomene forblir ukjent. Noen studier har antydet at dorsolateral prefrontal cortex (dPFC), rostralt anterior cingulate cortex (ACC), amygdala, hippocampus, periaqueductal grå (PAG), rostralt ventromediale medulla, og deres forbindelser med hverandre megle nociceptive behandling. ⁷ Tilleggsly, medial prefrontal cortex (MPFC) -amygdala kretser ble vist å være involvert i smerte-relaterte oppfatning. ⁸ Data om de patofysiologiske mekanismer CPSP er mangfoldig, og aktivering av nerve underlag i CPSP trenger ytterligere gransking.

^[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) opptak blir brukt til indirekte observere regional cerebral blodstrøm (rCBF), forutsatt en sammenheng mellom hjerneaktivitet og CBF. Selv ^[14 C] -IAP kan ikke vurdere hjernens aktivitet i sanntid, slik som med funksjonell magnetisk resonans imaging (fMRI), den har flere fordeler. For eksempel, ^[14C] -IAP er egnet for måling av spontant forekommende hjerne hendelser i løpet av patologiske tilstander. ⁹ Videre, ^[14C] -IAP opptaket målt uten bedøvelse. Det koster også mindre enn andre bildemetoder, inkludert fMRI og positronemisjonstomografi (PET). Den ^[14 C] -IAP metoden har blitt foreslått å være passende for measuring spontan smerte (f.eks CPSP) som er indusert ved lesjoner i den ventrale basal kjernen (VB) i thalamus. ⁹

Den nåværende protokollen beskriver hvordan du utfører ^[14 C] -IAP metode for å vurdere involvering av nevrale substrat for CPSP som er forårsaket av lesjoner i VB i thalamus i en dyremodell. Teknikken gir en måte å bestemme de patofysiologiske mekanismene som ligger til grunn CPSP symptomer på atferdsmessige og nevrale nivå.

Protocol

Protokollen i denne studien fått godkjenning fra Academia Sinica Institutional Animal Care og Utnyttelse komiteen i Taiwan. 1. Animal Forberedelser Oppnå Sprague-Dawley hannrotter (ca. 300-400 g). Opprettholde rottene i en luftkondisjonerte rom (21 – 22 ° C, 50% fuktighet) under en 12 timers / 12 timers lys / mørke syklus (lys på på 8:00) med fri tilgang til mat og vann. 2. Eksperimentell prosedyre Tillat alle rottene til å tilp…

Representative Results

Figur 1A viser den eksperimentelle tidslinjen. Rotter ble tildelt den humbug og CPSP grupper for de atferdsmessige tester (dvs. von Frey test og plantar test). Den første dag av forsøket tjente som grunnlinje, og testene ble gjentatt ved uke 1 – 5. PE-50 kateteriseringen ble utført i den ytre halsvene ved uke 4. heparin (20 U / ml, 0,1 ml / dag) ble injisert i løpet uke 4 og 5. Fem minutter etter heparin injeksjon, [14 C] -IAP ble injisert, fulgt …

Discussion

I atferdstester, den CPSP gruppen viste reduksjoner av pote uttak terskel i den termiske smerte test og mekanisk kraft i von Frey testen ved baseline og uker 1 -. 5. Funnene var i samsvar med en tidligere studie ¹⁴

Den ^[14C] -IAP metoden er avhengig av pikselintensiteten fra hjernen bilder for kvantitativ analyse av forskjellige hjerneskiver. For å evaluere dataene i hjernen bilder, ble det pikselsignalintensiteten definert. I denne studien ble miljøbakgrunnssignal de…

Materials

Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5-37.5°C.
10µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs:
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55°C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55°C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20°C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.