Étude de la fonction de Coronin A dans la réponse Starvation précoce de<em> Dictyostelium discoideum</em> Par agrégation Assays
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
Dictyostelium discoideum amibes se trouvent dans le sol, se nourrissant de bactéries. Lorsque les sources de nourriture se font rares, ils sécrètent des facteurs de lancer un programme de développement multicellulaire, au cours de laquelle des cellules individuelles chemotax vers les centres d'agrégation 1-4. Ce processus dépend de la libération de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) 5. AMPc est produit dans les vagues grâce à l'action concertée de l' adénylate cyclase et phosphodiestérases, et se lie à la protéine G couplée AMPc récepteurs 6,7. Un essai largement utilisé pour analyser les mécanismes impliqués dans le cycle de développement de la partie inférieure eucaryote Dictyostelium discoideum est basé sur l'observation de l' agrégation des cellules dans des conditions submergées 8,9. Ce protocole décrit l'analyse du rôle de coronine A dans le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus immergés dans une solution saline équilibrée (BSS) 10. Coronin A est un membre de la pr largement conservéefamille otein de coronins qui ont été impliqués dans une grande variété d'activités 11,12. cellules de Dictyostelium dépourvues Coronin A sont incapables de former des agrégats multicellulaires, ce défaut peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la 10 cascade AMPc. Les techniques décrites dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines pendant les premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum en amont de la cascade de l' AMPc. Par conséquent, l'utilisation de ce test d'agrégation peut permettre une étude plus approfondie des coronine Une fonction et de faire progresser notre compréhension de la biologie coronine.
Introduction
La famille coronine de protéines est fortement conservée tout au long des eucaryotes. Ces protéines sont caractérisées par la présence d'un tryptophane-aspartate amino-terminale (DEO) répéter contenant la région suivie d'une région unique connecté à un domaine coiled-coil carboxy-terminale 13,14 (figure 1). Coronins ont été impliqués dans une variété de fonctions cellulaires, y compris la régulation du cytosquelette et la transduction du signal 12. Chez les mammifères, jusqu'à six molécules courtes coronine (de coronine 1-6), ainsi que d' un «tandem» coronine 7, peuvent être co-exprimées 12,15. Coronin 1 est membre de la famille le plus étudié, et a été montré pour être impliqué dans la destruction des agents pathogènes, la survie des cellules T et la signalisation neuronale. Comment, exactement, coronine 1 réalise ces activités reste incertaine. Alors que coronine 1 a été montré pour réguler Ca 2+ et dépendante de l' AMPc de signalisation, ainsi que F-actine cytosquelette modulation 16-18, le co potentiel-expression jusqu'à 7 membres de la famille chez les mammifères a fait qu'il est difficile d'étudier la fonction moléculaire coronins dans ces systèmes, en raison de redondances possibles. Contrairement à des organismes mammifères, plus discoideum eucaryote Dictyostelium exprime seulement deux membres de la famille (coronine coronine de A, l'orthologue de mammifères coronine 1 et coronine B, l'orthologue de coronine mammifère 7) avec des fonctions apparemment non redondantes 15,19,20. Ce fait rend Dictyostelium discoideum un modèle puissant pour étudier la fonction de coronins.
Pour étudier le rôle de coronine A dans Dictyostelium discoideum, nous avons provoqué le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus contenant une solution tampon de sel (BSS) équilibrée en utilisant soit des cellules ou des cellules de type sauvage manquant coronine A 10. Nous avons constaté que les cellules dépourvues de coronine A ont été incapables de former des agrégats multicellulaires sur la famine. Pour une évaluation quantitative précise de ce phénotype duimagerie des cellules vivantes automatisé décrit dans ce protocole est un outil essentiel. Le défaut de l'initiation de la réponse précoce de famine dans les cellules dépourvues Coronin A peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la cascade AMPc. L'application exogène d'AMPc impulsions pour simuler le début du développement a été utilisé par plusieurs laboratoires dans le passé 8,9. Toutefois, cette procédure est également connu pour être fortement dépendante de la densité des cellules et la synchronisation. Par conséquent, le protocole décrit ici vise à réduire ces variabilités afin de garantir un degré élevé de reproductibilité. Pris ensemble, les techniques utilisées dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines au cours des premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum et ont le potentiel d'identifier amont ainsi que effecteurs en aval de coronine Une fonction.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protéines Coronin se trouvent dans la plupart des taxons de clade eucaryote. Dictyostelium discoideum coronine A, l'homologue de coronine mammifère 1, est impliquée dans la réponse de famine précoce, étant donné que Coronin A déficientes cellules ne sont pas capables de former des centres d'agrégation au cours du développement précoce cycle de 10. Pour être en mesure d'évaluer quantitativement et avec précision le retard dans le développement entre les souches, un micro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
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