Abstract
단백질 풍부 규제는 거의 모든 세포 과정에 매우 중요합니다. 단백질 풍부 단백질 합성 및 단백질 분해의 속도의 통합을 반영한다. 단백질 풍부한보고 많은 분석은 단백질 수준에서 번역 및 단백질 분해의 상대적인 효과의 차별을 허용하지 않습니다 (예를 들어, 단일 시점 웨스턴 블로 팅, 세포 계측법 형광 현미경, 또는 성장 기반 기자 분석 흐름). 이 문서는 특히 모델 단세포 진핵 생물의 단백질 분해를 분석하는 서양 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스의 사용, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모)에 대해 설명합니다. 이 과정에서, 효모 세포는 번역 억제제 인 사이클로 헥시 미드의 존재 하에서 배양 하였다. 세포의 분액 후 cycloheximide에 첨가 한 다음에 특정 시점에서 즉시 수집된다. 세포를 용해하고, 용 해물은 fo를 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 분리되고각 시점에서 단백질 풍부의 웨스턴 블롯 분석을 r에. 사이클로 헥 체이스 과정은 세포 단백질의 다양한 정상 모집단의 분해 동태 가시화를 허용한다. 절차는 단백질 분해에 대한 유전 적 및 환경 조건의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다.
Introduction
단백질은 거의 모든 세포 과정에 중요한 기능을 수행합니다. 많은 생리 학적 과정은 시간 또는 특정 상황에서 정의 된 기간 동안에 특정 단백질 (또는 단백질)의 존재를 필요로한다. 생물 따라서 모니터링 및 세포 요구 한 사항을 충족하기 위해 단백질 풍부를 조절한다. 예를 들어, 사이클린 (세포 분열 제어 단백질)는 세포주기의 특정 단계에 존재하며, 규제 사이클린 레벨의 손실은 악성 종양이 형성과 관련되어있다. 셀룰러 요구를 충족하기 위해 단백질 레벨을 조절하는 것 외에도, 세포는 잘못 폴딩, 조립되지 않은, 또는 기타 비정상적 단백질 분자 (3)을 제거 degradative 품질 제어 메커니즘을 사용한다. 단백질 풍부의 제어는 고분자 합성 (전사 및 번역) 및 분해 (RNA의 부패와 단백질 분해) 모두의 규정을 포함한다. 장애 또는 과도한 단백질 분해 여러 병리에 기여암, 낭포 성 섬유증, 신경 변성 상태, 및 심혈관 질환을 포함 4-8. 단백질 분해 메커니즘은 따라서 질병 9-12의 범위 유망한 치료 목표를 나타냅니다.
하나의 시점에서 단백질의 분석은 합성 또는 분해의 상대적 기여도를 공개하지 않고 정상 상태의 단백질 풍부의 스냅 샷을 제공합니다 (예를 들어, 웨스턴 블롯 (13)에 의해, 세포 계측법 (14), 또는 형광 현미경 (15) 흐름). 유사 성장 기반 리포터 분석은 합성 및 분해 15-20의 영향을 구별하지 않고 오랜 기간 동안 정상 상태의 단백질 수준을 반영한다. 이는 전에 풍부한 비교 및 약리학 보호 자전거를 비활성화하여, 예 degradative기구 (특정 성분을 억제 후, 정상 상태의 단백질 수준 degradative 프로세스의 기여도를 추정 할 수있다asome 21 가정 유전자를 노크는 분해 13)이 필요합니다. degradative 경로를 억제 한 후 정상 상태의 단백질 수준의 변화는 단백질이 풍부 (13)의 제어에 단백질 분해의 기여에 대한 강력한 증거를 제공합니다. 그러나, 그러한 분석은 아직 단백질 회전율의 동역학에 관한 정보를 제공하지 않는다. 웨스턴 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스는 연구자들이 시간이 22 ~ 24에 걸쳐 단백질 분해를 시각화 할 수 있도록함으로써 이러한 약점을 극복한다. 사이클로 헥시 미드 체이스 다음과 같은 단백질의 검출은 일반적으로 서쪽 블로 팅, 방사성 동위 원소 및 긴 면역 침전 단계에서 수행되기 때문에 또한, 또한 단백질 분해 (25)를 시각화하기 위해 수행된다 일반적으로 사용되는 펄스 추적 기술, 달리, 사이클로 헥시 미드 체이스 필요하지 않습니다.
사이클로 헥시 미드 먼저 항진균 적절한 가진 화합물로 확인되었다26, 27 griseus의 그램 양성 박테리아 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)에 의해 생성 된 관계. 이것은 특히 리보솜 전위 28-31을 손상하여 진핵 세포질 (그러나 organellar 생략) 번역을 저해하는 세포 투과성 분자이다. 사이클로 헥 체이스 실험에서 사이클로 헥시 미드는 세포에 첨가하고, 세포의 분취 량을 즉시 및 화합물 (22)을 첨가 한 다음에 특정 시점에서 수집된다. 세포를 용해하고, 각 시점에서의 단백질 존재 량은 전형적으로 웨스턴 블롯에 의해 분석된다. 자신 단백질 분해에 기인 할 수있는 사이클로 헥시 미드의 첨가 다음 단백질 풍부 감소한다. 상대적으로 안정적인 단백질이 풍부 작은 변화를 보이는 반면 불안정한 단백질은 시간이 지남에 풍부하게 감소 할 것이다.
선택적 단백질 분해의 메커니즘은 매우 Eukarya에 걸쳐 보존되어있다. 단백질 분해에 대해 알려진 내용의 대부분은 처음에 알게되었다모델 단세포 진핵 생물, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모) 25,32-36. 효모와 연구는 단백질 분해에 새롭고 중요한 통찰력을 계속 제공 할 가능성이 높다. 단백질 풍부한 웨스턴 블롯 분석 한 다음 효모 세포에 사이클로 헥시 미드 추격하는 방법이 여기에 표시됩니다.
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Protocol
효모 세포의 1. 성장과 수확
- 내인성 효모 단백질 분해 동력학을 분석하지 않으면, 관심있는 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 원하는 효모 균주 (들)을 변형. 효모를 형질 전환하기위한 신뢰할 수있는 방법은 이전에 37을 설명 하였다.
- 적절한 배지 5ml에 접종, 효모 (예를 들어, 형질 전환 된 세포를 비 형질 전환 세포에 대한 비 선택적 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 매체의 플라스미드 유지를위한 선택적 합성 정의 (SD) 중). 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
참고 : 30 ° C 전형적인 야생형 실험실 효모 (38)에 대한 최적 성장 온도이다. 몇몇 돌연변이 효모 균주는 30 ℃에서 최적 성장하지 않고, 일부 단백질은 온도에 따라 저하를 겪게 때문에, 효모 세포 성장 및 사이클로 헥시 미드의 추적에 사용되는 온도는 39 경험적으로 결정되어야한다. - 일을 측정각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 전자 광학 밀도.
참고 : 세포 대수 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한 = OD (600)에 희석 수 있도록 0.2 새로운 배지 ml의 15 것이다 밀도에 도달해야한다. - 새로운 배지 0.2 15 ml의의 OD 600 값으로 야간 문화를 희석.
- 세포 중순 로그 성장 단계에 도달 할 때까지 흔들어, 30 ° C에서 효모를 품어 (즉, OD 0.8과 1.2 사이의 600).
- 효모 세포 성장하는 동안, 상기 사이클로 헥시 미드 추격 절차에 대비하여 다음을 수행 :
- 사이클로 헥시 미드의 존재하에 세포 배양 30 ° C로 15 ml의 원추형 튜브를 수용 할 수있는 히트 블록을 설정한다. 배양에 효율적인 열 분배를 허용하는 열 블록의 웰에 물을 첨가. 15 ml의 원추형 튜브, 수위가 오버플로 상승하지만,하지 웰의 립을 일으킬 것 같은 각 웰 물을 넣어.
- 세포 용해 다음과 단백질 변성 95 ℃로 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 수용 할 수있는 제 2 열 블록을 설정합니다.
- 사전 따뜻한 신선한 성장 매체 30 ° C에 (분석 할 문화 시간당 포인트 당 1.1 ㎖).
- 50 μl의 20 배 정지 믹스를 추가 (문화 당 하나의 튜브 시간 당 포인트가 분석 될)의 microcentrifuge 튜브를 미리 표시. 얼음에 튜브를 놓습니다.
주의 : 나트륨 아 지드, 20 배 정지 믹스의 성분은 경구 섭취 또는 피부 접촉을 통해 독성. 준비, 저장, 아 지드 화 나트륨을 처리 할 때 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 실수로 노출의 경우, 제조업체에서 제공하는 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오.
- 세포 중순 로그 성장에 도달하면, 시점에 따라 각 문화의 2.5 OD 600 단위를 수집하는 것은 (예를 들어, 7.5 OD 600 단위 세 시점에서 단백질 풍부을 분석하기 위해) 분석된다. 원심 분리기는 3,0에서 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집2 분 동안 실온에서 00 XG.
참고 : 하나의 OD 600 단위는 OD 1.0의 600에서 1 ml의 문화에 존재하는 효모의 양이 동일하다. V = X OD 600 단위 / OD 600의 측정 : X OD 600 단위 (V)을 수확하는 데 필요한 배양 (ML)에서의 부피는 다음 식을 이용하여 결정될 수있다. 예를 들어, OD 1.0 600 효모 세포 배양의 7.5 OD 600 단위를 수확 7.5 OD 600 단위 / 1.0 = 7.5 ml의 효모 문화를 수집합니다. - 30 ° C (7.5 OD 600 유닛의 예 3 ㎖) 세포를 2.5 OD 600 단위당 (예열) 신선한 성장 배지 1 ㎖를 각 세포 펠렛을 재현 탁.
2. 사이클로 헥시 미드 체이스
- 30 ° C 열 블록에서 5 분 동안 배양 효모 세포 현탁액을 평형.
- 0시에서 카운트하는 타이머를 준비합니다.
- 타이머의 사이클로 헥시 미드 추격을 눌러 "시작"을 시작합니다. 신속,하지만 신중하게 다음 단계를 수행합니다 :
- 제 효모 세포 현탁액에 250 ㎍ / ml의 최종 농도 cycloheximide에 추가 (예를 들면, 세포 현탁액의 3 ㎖, 20 ㎎ / ㎖ 사이클로 헥 재고 37.5 μL 추가) 및 와류 간단히 혼합.
주의 : 사이클로 헥시 미드는 피부 자극과 경구 섭취를 통해 독성. , 제조, 저장 및 사이클로 헥시 미드를 처리 할 때 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 실수로 노출의 경우, 제조업체에서 제공하는 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. - 즉시 및 사이클로 헥 텍싱를 추가 한 후, 50 μl의 빙냉 20 배 스톱 믹스를 함유하는 미리 라벨링 microcentrifuge 관에 첨가 사이클로 헥시 미드와 효모 세포 현탁액 950 μL (~ 2.4 OD 600 단위)를 옮긴다. 모든 샘플이 수집 될 때까지 얼음에 microcentrifuge 관,과 장소를 소용돌이.
- 30 ° C에 효모 세포 현탁액을 돌려줍니다.
- 제 효모 세포 현탁액에 250 ㎍ / ml의 최종 농도 cycloheximide에 추가 (예를 들면, 세포 현탁액의 3 ㎖, 20 ㎎ / ㎖ 사이클로 헥 재고 37.5 μL 추가) 및 와류 간단히 혼합.
- 단계를 반복 2.3을 통해 2.3.10.3 일정한 시간 간격 (AT 나머지 효모 세포 현탁액을 각각 예를 들면, 사이클로 헥시 미드를 첨가되도록 매 30 초 1:00에서 0:30에서 0:00에서 샘플 # 3 샘플 # 2 # 샘플 1 , 등.).
- 이후의 각 시점에서, 50 ㎕의 사전 냉장 20 배 정지 믹스를 포함하는 라벨의 microcentrifuge 튜브에 소용돌이 효모 세포 현탁액 및 전송 950 μL. 소용돌이와 얼음에 장소 수집 세포. 30 ° C 열 블록에 15 ml의에게 원뿔 튜브를 돌려줍니다.
- 예를 들어, 30 분 사이클로 헥시 미드 첨가 한 후 세포의 수집, 소용돌이합니다 (시간 코스의 시작 부분에 효모 세포 현탁액에 사이클로 헥시 미드 추가 사이에 30 초 간격으로 가정)과 30:00에서 샘플 # 1에서 세포 현탁액 950 μl를 제거 . 등등 30:30에 샘플 # 2에 대해 반복합니다.
주 : 추적의 과정을 통해 원뿔 튜브 약 5 분마다 15 ㎖에 효모, 소용돌이 세포 현탁액의 침전 방지합니다. 대안 적으로, 효모 세포 현탁액S는 사이클로 헥 체이스 실험 기간 동안 연속적으로 교반 수조에서 유지 될 수있다.
- 예를 들어, 30 분 사이클로 헥시 미드 첨가 한 후 세포의 수집, 소용돌이합니다 (시간 코스의 시작 부분에 효모 세포 현탁액에 사이클로 헥시 미드 추가 사이에 30 초 간격으로 가정)과 30:00에서 샘플 # 1에서 세포 현탁액 950 μl를 제거 . 등등 30:30에 샘플 # 2에 대해 반복합니다.
- 모든 샘플이 수집되면, 펠렛을 30 초 동안 실온에서 6500 × g으로 원심 분리하여 세포를 모았다. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 셀은 알칼리 용해에 대한 준비가되어 있습니다. 또한, 스냅인 동결 액체 질소 저장에서 펠렛 세포를 -80 ° C에서.
3. 후 알칼리성 단백질 추출 (16,40에서 수정)
- 각 세포 펠렛에 증류수 100 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래 또는 텍싱에 의해 재현 탁.
- 각 샘플에 0.2 M NaOH를 100 μl를 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 아래로 또는 텍싱 섞는다.
- 실온에서 5 분간 현탁 세포를 인큐베이션. 이 단계에서, 효모 세포는 용해되지 않았으며 단백질 40 출시되지 않았다.
- 객실 성질에서 18,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포30 초 동안 ature. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 세포를 용균 각 세포 펠렛에 램 믈리 샘플 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래 또는 텍싱에 의해 재현 탁.
주 : 트리스 - 글리신 러닝 버퍼 시스템을 사용하여 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)과 호환 가능한 형태 중의 NaOH 및 램 믈리 시료 완충액 방출 단백질과 세포의 연속 배양. - 5 분 완전 단백질의 변성, 95 ℃에서 인큐베이션.
참고 : 95 ° C에서 배양이 응집하는 경향이 단백질의 분석에 적합하지 않을 수 있습니다 (예를 들어, 여러 횡단 세그먼트와 단백질). 고온 (41)에서 배양 할 때이 단백질은 불용성 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 단백질의 분석을 위해, 해물이 낮은 온도에서 항온 처리한다 (예를 들면, 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 분 등 경험적으로 결정된다. - RO에서 18,000 XG에 원심 분리기 해물1 분 동안 엄마 온도는 불용성 물질을 펠렛합니다. 상층 액 (용해 추출 된 단백질) SDS-PAGE 및 후속 웨스턴 블롯 분석에 의해 분리를위한 준비가되어 있습니다. 또한, -20 ° C에서 저장 용 해물.
4. 대표 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅 절차 (16에서 적응)
- 로드 단백질 분자량 표준 및 SDS-PAGE 젤 상 해물의 경험적으로 결정된 볼륨.
주 : 관심있는 단백질의 분자량에 기초하여 SDS-PAGE 젤에서 아크릴 아미드, 비스 - 아크릴 아미드의 비율을 선택. 일반적으로 낮은 퍼센트 겔은 고 분자량 단백질을 해결하기 위해 더 적합하다. - 염료 앞에까지 200 V에서 실행 젤은 젤의 아래쪽 가장자리에 도달했습니다.
- 4 ℃에서 90 분 - 60 20 V에 젖은 송금으로 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 겔에서 단백질을 전송합니다.
- (TB TBS 버퍼에 배양에 의해 막을 차단S), 5 % 탈지유를 함유하는 1 시간 동안 또는 밤새 4 ℃의 실온에서 흔들.
참고 밤새 인큐베이션 멤브레인의 존재하에 미생물 성장을 방지하기 위해, 0.02 %의 최종 농도에서 차단 용액에 아 지드 화 나트륨을 포함하는 것을 권장한다. - 실온에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 -20 (TBS / T) 및 1 % 탈지 우유, 락과 TBS 관심 단백질에 특이적인 일차 항체와 막을, 부화.
- 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
- 락, 실온에서 1 시간 동안 1 % 탈지 우유와 함께 TBS / T에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어.
참고 : 형광 발색단은 빛에 민감하다. 따라서, 형광 물질에 접합 된 항체의 희석액을 어둠 속에서 제조하고, 막 배양 차광판 (예, 호일 랩) CO 발생한다 형광체 이후 세척 단계에 접합 된 항체의 존재해야ntainers. - 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
- LI-COR 오디세이 (CLx)를 제조사 권장 다음 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)를 사용하여 이미지 막.
- 멤브레인 영상을 획득 한 후, 락, 실온에서 1 시간 동안 1 % 탈지 우유 TBS / T의 로딩 조절 단백질에 특이적인 일차 항체와 함께 막을 배양한다.
- 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
- 락, 실온에서 1 시간 동안 1 % 탈지 우유와 함께 TBS / T에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어.
- 락, TBS / T 실온에서 3 × 5 분을 막 씻으십시오.
- 단계 4.9에서와 같이 이미지 막.
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Representative Results
사이클로 헥시 미드 체이스 방법을 설명하기 위해, Deg1 -Sec62의 안정성 (그림 1), 모델 효모 소포체 (ER) -associated 저하 (ERAD) 기판, 42-44을 분석 하였다. ERAD에서 품질 관리 유비퀴틴 리가 아제 효소는 공유 결합 ER 막에 지역화 된 비정상적인 단백질에있는 작은 단백질의 유비퀴틴의 체인을 연결합니다. 이러한 polyubiquitylated 단백질이어서 ER에서 제거되고 테아 큰, 세포질 프로테아제 (45)에 의해 분해된다. 그것은 지속적으로하고 비정상적으로 translocon, 응급실 루멘 또는 막 (43)에 단백질 전위를 용이하게하는 채널을 결합 후 Deg1 -Sec62 단백질은 분해의 대상이된다. 유사하게, 포유 동물의 아포 B, 저밀도 리포 단백질의 단백질 성분은 지속적 ER의 translocon 결합이어서 그 때 립 관련된 메카니즘에 의해 열화를 겪는ID 바인딩 파트너는 46-48 존재하지 않는다. (translocon 관련가) 43 기판들 때문에, 지속적으로 또는 비정상적으로 translocon 결합 단백질의 분해에 대한 통찰력을 얻을 수있다 효모 세포에 Deg1 -Sec62 저하 분석, 임시 ERAD-T라고합니다.
이전 연구는 유비퀴틴 접합 효소 Ubc7와 ER-상주 유비퀴틴 리가 아제 Hrd1 기능 Deg1 -Sec62 16,42-44의 분해를 촉진하는 것으로 나타났다있다. 횡단 단백질 Cue1는 ER 막에 Ubc7을 고정 효소 49-51을 활성화합니다. 그러나 Deg1 -Sec62의 분해에 Cue1에 대한 요구 사항은 직접 조사되지 않았다. Cue1이 Hrd1 및 Ubc7 같은 Deg1 -Sec62을 효율적으로 분해에 필요한 가설을 테스트하려면 Deg1 -Sec62을 표현 야생형과 돌연변이 효모 세포는 사이클로 헥시 미드 체이스와 WES을 실시 하였다제비 갈매기 블롯 분석 (그림 2A). Deg1 -Sec62 단백질은 여러 종으로 SDS-PAGE에 마이그레이션합니다. 이는 단백질 43,44,52 광범위 번역 후 변형을 나타내는 이전의 연구와 일치한다. 야생형 효모 세포에서 Deg1 -Sec62 용이하게 저하되었다. 이전에 관찰 된 바와 같이, Hrd1 또는 Ubc7 하나의 손실은 실질적으로 Deg1 -Sec62 단백질 42-44 안정화. 예측 된 바와 같이, Deg1 -Sec62는 ERAD-T에서 Ubc7 상호 작용하는 단백질에 대한 역할을 확인 (Ubc7의 부재와 동일한 정도) Cue1의 부재하에 안정 하였다.
각 시점에서 남아있는 Deg1 -Sec62 단백질의 비율로 정량하고,도 2b에 도시된다. 우리는 야생 형 세포에서 Deg1 -Sec62의 실종의 겉보기 속도가 초기 Deg1 -Sec62의 분해 속도의 과소 평가 될 수 있습니다(즉, 가장 직접적으로 펄스 추적 분석 (43)에 의해 결정될 수있다 단백질의 반감기). 야생형 효모 적극적 사이클로 헥시 미드 추가하기 전에 Deg1 -Sec62 단백질을 분해하기 때문에, Deg1 -Sec62의 정상 상태 풍부 실질적으로 (열화 손상되는 세포에 비해)이 세포 감소된다. 이는도 2a에 각 균주의 초기 시점에서 Deg1 -Sec62의 풍부함을 비교함으로써 알 수있다. (단백질 분해가 방지되는 세포 풀에 쌓이면 예) 또한, 기판의 단백질의 임의의 열화 방지 모집단 실험의 시간 경과에 걸쳐 야생형 세포에서 비교적 안정 나타날 것이다.
Deg1의 저하 그림 1. 모델 -Sec62 Translocon의 비정상적인 참여 (A) Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 순서에서 다음 요소로 구성 도식 묘사 다음과 같습니다.. Deg1 (효모 전사 리프레 MATα2에서 아미노 - 말단 67 아미노산), 플래그를 (F) 에피토프, 2 막 관통 단백질 Sec62하고 소포체 (ER) 막에 두 개의 트랜스 세그먼트 정상 공동 병진 삽입 후 포도상 구균 단백질 A (PRA). (B)의 두 복사본 영구 협회 translocon와 Deg1 -Sec62 비정상적인, Deg1의 의존성, 번역 후 translocon 참여를 트리거의. 세포질 아미노 말단의 일부가 비정상적으로 내 - 더 translocon 유지 가능성에 진입-합니다. (C) translocon 참여 후, Hrd1의 유비퀴틴 리가 아제는 Deg1 -Sec62는 ubiquitylates. Hrd1는 유비퀴틴 접합 효소 U의 도움된다Cue1에 의해 ER 막에 고정되어 BC7. UB, 유비퀴틴 단백질 단량체. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62는 ER 막에서 추출되고 translocon 폐쇄를 완화, 프로 테아 좀에 의해 분해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
웨스턴 블로 팅 다음 그림 2. 사이클로 헥시 미드 체이스 Cue1는 효율적인 Deg1 -Sec62 저하에 필요한 있음을 나타냅니다. 표시된 유전자형 (A) 효모 세포는 효모 센트로 미어 플라스미드 인코딩 Deg1 -Sec62로 형질 전환 된 (pRS416-P MET25 - Deg1 -flag-Sec62-2xProtA, AmpR / URA3 43)과 사이클로 헥시 미드 체이스 분석을 실시. 단백질(0.125 OD 600 단위에 상당) 각 시점에서 S는 8 % SDS-PAGE 겔상에서 분리하고, 웨스턴 직접 Deg1의 C 말단 단백질 A 에피토프에 결합 토끼 항 - 마우스 이차 항체로 블 롯팅에 의해 검출 하였다 - Sec62 융합 단백질. 로딩 대조군으로서, 막은 후속 Pgk1에 특이적인 항체와 함께 배양 하였다. 이 실험은 세 번 복제 된; 대표적인 결과를 묘사한다. 데이터의 (B) 정량 (A) 이미징 소프트웨어 (자재 표 참조)를 사용하여 수행 하였다. Deg1 -Sec62 단백질을 포괄 영역의 총 형광 강도를 각 샘플에 대해 측정 하였다. 각 샘플에 대한 배경 형광 강도는 Deg1 -Sec62 단백질 근방 화소의 평균 형광 강도로부터 외삽 하였다. 이는 외삽 배경 형광 강도를 조정 fluoresc을 수득 총 형광 강도로부터 감산 된각 샘플 런스 강도. 총 배경 및 조정 형광 강도에 대한 유사 정량화는 Pgk1, 그 풍요 로움 분석 조건에서 변화하지 않는 부하 제어 단백질을 실시 하였다. 샘플 중 Deg1 -Sec62 단백질 풍부 비교하기 Pgk1에 Deg1 -Sec62의 조정 된 신호 강도의 비율은 각 샘플에 대해 측정 하였다. Deg1 -Sec62 / Pgk1 비율 분석중인 각 균주 (즉, 사이클로 헥 즉시 첨가 후) 제 시점 100 %로 정의 하였다. (즉, Deg1 -Sec62 / Pgk1 비율이 즉) 첫 번째 시점에서 Deg1 -Sec62 / Pgk1 비율의 백분율로 계산 된 이후의 시점에서 남아있는 Deg1 -Sec62의 양. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
| 합성 정의 (SD) 최소 효모 중간 | 2 % 포도당, 아미노산없이 0.67 % 효모 질소 염기, 0.002 % 아데닌, 0.004 % 우라실, 0.002 %의 아르기닌 0.001 % 히스티딘, 0.006 %의 이소 로이신 0.006 % 루신, 0.004 %의 리신, 0.001 % 메티오닌, 0.006 % 페닐알라닌 0.005 %의 쓰 레오 닌, 0.004 %의 트립토판. 고체 (판) 매체의 경우, 2 % 한천을 포함한다. | 1. 선택 배지는 적절한 아미노산 (들) 또는 질소 함유 염기를 생략하여 제조된다. |
| 다음과 같이 편의를 위해 2.,이 성분을 농축 원액으로 유지 될 수있다. 아미노산은 모든 목적하는 아미노산을 함유 100X 원액으로 유지 될 수있다. 효모 질소 염기는 20 배 스톡 용액 (13.4 %)에서 유지 될 수있다. 포도당은 40 % 저장 용액으로 유지 될 수있다. 아데닌과 우라실 0.1 M NaOH를 1 %의 원액으로 유지 될 수있다. | ||
| 삼.고압 증기 멸균에 의해 매체를 소독. | ||
| 효모 추출물 - 펩톤 덱 스트로스 (YPD) 리치 효모 중간 | 1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스 트 로즈 (선택 사항 : 0.002 % 아데닌). 고체 (판) 매체의 경우, 2 % 한천을 포함한다. | 1. 아데닌의 느린 성장과 특정 실험실 효모 균주 붉은 채색 특성 부재하에 (또는 낮은 풍부)을 방지하기 위해, 아데닌이 YPD 성장 배지에 첨가 될 수있다. |
| 다음과 같이 편의를 위해 2. 일부 성분을 농축 원액으로 유지 될 수있다. 포도당은 40 % 저장 용액으로 유지 될 수있다. 아데닌 0.1 M NaOH를 1 % 원액으로 유지 될 수있다. | ||
| 3. 고압 증기 멸균에 의해 매체를 소독. | ||
| 20 배 정지 믹스 | 200 mM의 나트륨 아 지드를 5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 | 아 지드 화 나트륨은 경구 섭취 또는 피부 접촉을 통해 독성. 제조업체에 따라추천 정보는 제조, 저장 및 아 지드 화 나트륨을 취급 할 때. 실수로 노출의 경우, 제조업체에서 제공하는 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. |
| 20 ㎎ / ㎖ 사이클로 헥 | 1. 에탄올에 준비합니다. -20 ° C에서 보관하십시오. | |
| 2. 사이클로 헥시 미드는 피부 자극과 경구 섭취를 통해 독성. , 제조, 저장 및 사이클로 헥시 미드를 처리 할 때 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 실수로 노출의 경우, 제조업체에서 제공하는 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. | ||
| 0.2 M 수산화 나트륨 | 물을 준비합니다. 수산화 나트륨은 유리와 반응한다. 따라서, 장기 보존에 0.2 M 수산화 나트륨을 플라스틱 용기에 보관하여야한다. | |
| 램 믈리 시료 완충액 | 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 5 % 및# 946; 메르 캅토 에탄올, 60 mM 트리스 염산의 pH 6.8, 블루 0.008 % 브로 모 페놀 | 1. 램 믈리 시료 완충액은 종종 높은 농도 (예를 들면, 5 배) 스톡을 희석함으로써 제조된다. |
| 2. 염료 브로 모 페놀 블루 원하는 강도에 첨가 될 수있다. A "핀치"(주걱 모서리 탭 미량)는 일반적으로 충분하다. | ||
| 램 믈리가 버퍼를 실행 (5 배) | 125 mM 트리스, 960 mM의 글리신, 0.5 % SDS | 1 배 램 믈리 1 L 버퍼 실행을 준비하려면 1 희석 : 5 DH 2 O.에서 |
| 트리스 아세테이트 - SDS 전송 버퍼 (5 배) | 125 mM 트리스 아세테이트 (PH 8.8), 960 mM의 글리신, 0.05 % SDS | , 버퍼로 이동 1X 트리스 아세테이트 - SDS의 20 L를 준비 5 배 주식의 4 L, 메탄올 4 L, 및 DH 2 O. 12 L를 결합하려면 |
| 10 배 TBS 버퍼 (TBS) | 500 mM 트리스, 1.5 M의 NaCl; pH는 7.5로 조정 | 1X TBS의 1 L를 준비하려면, DH 2 O.에서 1:10 희석 1X TBS는 적절한 세제 트윈 20, 탈지 우유로 보충 될 수있다. |
본 연구에 사용 된 표 1. 솔루션.
| 스트레인 이름 | 별명 | 관련 유전자형 | 참조 |
| VJY42 | MHY501 | MATα | Chen 등. 1993 |
| HIS3 - Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| VJY47 | YWO55; MHY507 | MATα | JUNGMANN 등., 1993; 루벤스 타인 등., 2012 |
| HIS3 - Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| ubc7Δ ::는 Leu2 | |||
| VJY56 | YTX105; MHY1364 | MATα | Biederer 등., 1997; 니치 라 비드 등., 2006 |
| HIS3 - Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| cue1Δ :: HIS3 | |||
| VJY172 | MHY6199 | MATα | 이 연구 |
| HIS3 - Δ200 | |||
| leu2-3,112 | |||
| ura3-52 | |||
| lys2-801 | |||
| trp1-1 | |||
| gal2 | |||
| hrd1Δ :: kanMX4 |
본 연구에 사용 된 표 2. 효모 균주. 모든 균주 MHY500 53 congenic 있습니다. VJY42, VJY47 및 VJY56는 이전에 49,53,54 설명했다. (이 연구를 위해 준비) VJY172에 대한 자세한 변형 생성 및 확인 전략은 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
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Discussion
본 논문에서는 단백질 분해의 동력학을 분석하는 방법이 제시된다. 이러한 기술은 용이하게하는 다양한 메커니즘에 의해 열화 된 단백질의 범위에 적용될 수있다. 또한 사이클로 헥 체이스 실험 주어진 단백질의 정상 풀 분해 동역학보고 것이 중요하다. 다른 기술은 단백질의 특정 집단의 분해 동력학을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 초기 폴리 펩타이드의 degradative 운명은 펄스 추적 분석 (55)에 의해 추적 할 수 있습니다. 이러한 실험에서, 초기 단백질 간단히 펄스 - 표지 (예, 방사성 아미노산)이다. (또는 정상 상태의 단백질 풍부의 변화를 반영하지 않을 수도 있습니다) 표지 된 초기 단백질의 풍부한의 변화는 시간이 지남에 따라 추적 할 수있다.
사이클로 헥 체이스 (즉, 최대 2 시간) 상대적으로 짧은 시간 과정 동안 단백질의 안정성을 분석하기에 적합하다. 긴 시간 C 이상ourses (즉, 이일 시간), 사이클로 헥시 미드, 번역의 글로벌 억제제 인해 유비퀴틴 (56)의 고갈 가능성, 세포 독성. 또한, 긴 시간 과정 동안 단백질 안정성 분석은 관심있는 단백질 (의 열화에 전체적으로 손상된 단백질 합성의 간접적 인 효과에 의해 손상 될 가능성이있는 등의 단백질 분해에 관여 단명 단백질 분해 관심). 이러한 펄스 체이스 대사 표지 실험과 같은 다른 기술은, 따라서 더 적합한 긴 수명이 단백질의 분해를위한 연구 및 사이클로 헥 체이스 실험에서 얻어진 결과를 확증하기 위해 수행 될 수있다.
세포를 사이클로 헥시 미드 및 컬렉션의 첨가시기는이 절차에있어서 중요한 고려 사항이다. 시간에서 작은 편차가 사이클로 헥 ADDI의 경과로 정밀도가 매우 단명 단백질의 분석에 특히 중요세포 수확에 기 명백한 분해 반응 속도에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한,이 시간에 민감한 단계를 실행하기위한 명확한 계획없이, 실험 빠르게 혼란과 좌절로 바뀔 수 있습니다. 이 때문에,이 계획 정기적 배양에 사이클로 헥시 미드를 추가 할 것을 권장한다. 30 초 간격이 프로토콜에서 제시되지만, 타이밍 연구자의 쾌적함 수준 및 기민성과 일치하도록 조정할 수있다. 초보자 연구자들은 유용 이전에 실험을 시작하기에 시료 채취 시간의 일정을 작성하고 발생하는 각 예정 컬렉션을 건너 찾을 수 있습니다.
단계 1.7 및 여기에 설명 된 프로토콜 1.8 효모 세포 배양 후속 사이클로 헥 체이스 과정에서 조작의 용이성을위한 성장 배지의 부피 감소에 집중된다. 그러나, 효모 세포의 원심 분리가 빠르게 특정 세포 스트레스 반응 (예를 들면, 신호 전달 경로를 유도함포도당 박탈) 57, 58에 의해 활성화된다. 연구자들은 따라서 원심의 연장 된 기간에 대해주의한다. 원심 분리에 민감 할 수있다 단백질의 안정성을 분석 할 때, 연구자들은 이전에 원심 분리하지 않고 중반 로그 위상 문화에 직접 사이클로 헥시 미드를 추가 할 수 있습니다. 이러한 경우에, 사이클로 헥 동일한 최종 농도 (250 μg의 / ㎖)에 첨가되어야하고, 효모 세포 샘플의 초기 원심 분리 공정 (예를 들면, 신속한 여과) (57)을 필요로하지 않는 방법에 의해 수확 될 수있다. 또한, 단계 2.3-2.5은 각 시점에서 수집 된 샘플을 아 지드 화 나트륨을 함유하는 용액에 전송하고 얼음에 두었다. 이러한 조건은 체이스 기간 동안 단백질 분해를 계속해서 억제한다. 또한 아 지드 화함으로써 구체적 ATP 의존적 프로테아제의 활성을 억제, ATP (59)의 세포 농도를 감소 시킨다는 것을 주목하여야한다. 동안 감소 된 온도해야LSO는 이러한 메커니즘에 의해 분해 단백질을 공부하는 연구자가 선택적으로 각 샘플이 채취 될 때 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결 스냅 선택할 수있는 비 ATP 의존적 인 단백질 분해 과정 기능 속도를 줄일 수 있습니다.
세포 용해 및이 원고에 포함 된 서부 블로 팅에 대한 대표적인 프로토콜에 대한 샘플 프로토콜은 이전 보고서 16,40에서 적응하고있다. 여기에 기재된 후 알칼리 분해 방법에있어서, 수산화 나트륨 전처리 램 믈리 시료 완충액의 후속 첨가시 효모 단백질의 추출을 향상시킨다. 이 향상이 발생하는 메커니즘은 제대로 (40)을 특징으로한다. 그러나, 효모의 세포벽에서 발견되는 다당류는 알칼리 조건 (60)에 용해된다. 따라서, 그들에게 더 sensitiv 렌더링 (즉, 세포벽 성분을 제거) 부분적으로 또는 완전히 효모 세포 spheroplasts 수산화 나트륨의 존재 하에서 그 인큐베이션 추측 유혹램 믈리 시료 완충액에서 SDS 세제 현재까지 E. 단백질이 높은 변성 조건에서 방출되기 때문에, 프로테아제 억제제는 램 믈리 시료 완충액에 포함 할 필요는 없다. 세포 용해의 구체적인 방법은 주어진 실험에서 적절하게 변형 될 수있다. 예를 들어, 후 알칼리 용해 방법은 제대로 웨스턴 블롯에 의해 검출 된 미량의 단백질 또는 단백질 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우, 61에서 가장 적합 할 수있다 단백질 시료를 농축하는 트리클로로 아세트산 침전 단계를 포함하는 방법이다. 또한, 항체 선택에 관한 몇 가지 중요한 고려 사항,로드 제어 선택 및 탐지의 대체 수단 (예를 들면, 필름 또는 디지털 이미징 시스템을 사용하여 화학 발광 웨스턴 블로 팅)는 최근되었습니다 (16)에 대해 논의했다. 사이클로 헥시 미드 치료를 다음과 단백질 풍부의 정량이 수행 될 수있다. 대부분의 이미징 시스템은 용이하게 소프트웨어 패키지로 판매이 분석.
사이클로 헥 체이스 효모 단백질의 다양한 열화를 분석하도록 구현 될 수도 있고 다른 진핵 세포에서의 단백질의 안정성을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 이 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 사이클로 헥시 미드 치료는 세포 용해 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 단백질 풍부 검출옵니다. 애플리케이션에 따라, 그러나, 사이클로 헥시 미드 처리 다음 단백질 풍부 연구 목적을위한 적절한 기술의 범위에 의해 평가 될 수있다. 단백질 크기 분석을위한 중요한 요인이 아닌 경우, 예를 들어, 세포 용 해물은 단백질 풍부보고 도트 블롯 또는 효소 면역 분석법 (ELISA) 분석을 실시 아니라 겉보기 분자량 62 될 수있다. 세포 표면 단백질, 유세포 cycloheximide에 첨가 한 후 51 시간에 서로 다른 샘플의 단백질 존재 량을 정량하는 데 사용될 수있다 (또는 내부 내부 형광 단백질 태그). FLUOrescence 현미경 다음 사이클로 헥시 미드 치료 단백질 풍부하고 현지화 (18) 모두에 대한 정보를 제공합니다. 기판, 생물 및 사이클로 헥시 미드 체이스 의무가 다운 스트림 응용 프로그램의 범위는 기술을 단백질 분해를 연구의 매우 다양하고 유익한 수단이 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | |||
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | A tube roller is recommended to maintain overnight starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heaters | Fisher Scientific | 1172011AQ | It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins. |
| Heating block for 12 x 15 ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-473-70 | For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide. |
| Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes | Fisher Scientific | 11-718-9Q | For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation. |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
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